姜黃素對肺癌細胞的放療增敏作用及機制研究

林清認，周霞

（浙江省腫瘤醫(yī)院 放療科，浙江 杭州 310022）

姜黃素對肺癌細胞的放療增敏作用及機制研究

林清認，周霞Δ

（浙江省腫瘤醫(yī)院 放療科，浙江 杭州 310022）

目的觀察姜黃素對肺癌NCI-H446細胞的體外放療增敏作用，探討其可能的機制。方法體外培養(yǎng)肺癌NCI-H446細胞，分為對照組、姜黃素處理組、X射線干預組以及聯(lián)合干預組。對照組僅給予等體積培養(yǎng)基，姜黃素處理組給予不同濃度姜黃素處理48 h，X射線組采用X射線照射（劑量率250 cGy／min），聯(lián)合治療組細胞先采用姜黃素處理，之后使用X射線照射。采用MTT法檢測各處理組細胞增殖情況，流式細胞術檢測細胞凋亡，Western blot檢測細胞中p53、p21、Bax、Bcl-2蛋白表達。結果不同濃度的姜黃素對人肺癌NCI-H446細胞生長具有抑制作用；劑量為6～12 Gy的X線處理后，也可顯著抑制NCI-H446細胞增殖；不同濃度姜黃素和8Gy X線處理后，NCI-H446細胞增殖進一步降低，并與姜黃素濃度呈一定的劑量依賴性。流式細胞術結果顯示：姜黃素和X射線照射均可促進細胞凋亡；2者聯(lián)合使用與單純姜黃素或X射線照射相比細胞凋亡顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Western blot結果顯示：姜黃素與X射線均能誘導NCI-H446細胞中p53、p21和Bax蛋白表達，降低Bcl-2蛋白表達（P＜0.05）。X射線與姜黃素聯(lián)合處理后，p53、p21和Bax以及Bcl-2蛋白含量比單獨作用變化顯著，差異有統(tǒng)計計學意義（P＜0.05）。結論姜黃素對人NCI-H446細胞具有放療增敏作用，其機制與誘導細胞凋亡，上調p53、p21蛋白及下調Bcl-2／Bax表達有關。

姜黃素；肺癌細胞；放療

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑與儀器 姜黃素（Sigma-Adrich，純度≥95%），用二甲基亞砜（DMSO）溶解；細胞培養(yǎng)基購自Invitrogen公司、細胞蛋白提取試劑盒購自 Thermo；碘化丙啶（PI）購自Sigma-Adrich，抗人 p53、p21、Bax和 Bcl-2抗體購自 Santa Cruz；ECl化學發(fā)光試劑盒購自Amersham Pharmacia公司；MTT試劑盒購自江蘇碧云天生物技術有限公司。主要儀器：流式細胞儀（FACSCalibur system，BD），分 光 光 度 計 （BioPhotometer spectrophotometer，Eppendorf），醫(yī) 用 加 速 器 （Clinac 600 C／D，Varianmedical systems）。

1.2 細胞培養(yǎng)及活性檢測 人小細胞NCI-H446肺癌細胞株（中南大學腫瘤研究所提供）用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。分別設立對照組、姜黃素處理組、X射線干預組以及聯(lián)合干預組。對照組不做處理，姜黃素處理組給予25μmol／L處理48 h，X射線組采用X射線照射（劑量率250 cGy／min），聯(lián)合干預組給予不同濃度姜黃素和X射線。MTT法檢測姜黃素對NCI-H446細胞增殖的影響。取不同濃度姜黃素和不同劑量X射線處理后的NCI-H446細胞，每孔加入30μLMTT溶液（1 g／L），37℃孵育 2 h后棄上清，加入200μL DMSO，充分混勻，用酶標儀測定各孔吸光度值（A570），計算抑制率。抑制率＝（對照組A值-實驗組A值）／對照組A值×100%。取抑制率為20%～30%時的姜黃素濃度和射線劑量進行后續(xù)實驗。

1.3 細胞凋亡檢測 NCI-H446細胞孵育結束后，棄上清，PBS輕洗2次，重懸制備單細胞懸液，計數(shù)并調整細胞密度至5×105個／mL。取1mL細胞，1 000 r／min離心 5 min，離心棄上清；用195μL Binding Buffer輕重懸并加入5μL Annexin-V／FITC輕混勻，室溫避光孵育 10 min；1000r／min離心 5 min，沉淀加入190μL Annexin-V／FITC結合液輕重懸細胞，再加入10μL PI輕輕混勾，冰浴避光反應10min后用于流式細胞術分析。

1.4 Western blot 細胞處理完畢后，800 r／min離心5 min，棄上清，用冰冷的PBS洗滌細胞2次。加入200μL細胞裂解緩沖液重懸浮細胞，冰上裂解40min。1 000 r／min離心15min后，上清即為細胞總蛋白。對于細胞漿蛋白提取，將細胞沉淀每20 μL細胞沉淀的體積，加入200μL預冷的溶液A工作液，最大轉速渦旋劇烈振蕩10 s。放置冰上10～15 min。隨后加入11μL冷溶液B，渦旋劇烈振蕩5 s，冰上裂解1min。再次振蕩5 s后，4℃離心5min。上清即為細胞漿蛋白。上述蛋白經(jīng)5%～15%SDS-PAGE后，Western blot檢測 p53、p21、Bax和 Bcl-2的表達。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料采用單因素方差分析，兩組間比較用t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度姜黃素對NCI-H446細胞增殖的影響 陰性對照組NCI-H446細胞增殖活躍。用不同濃度的姜黃素作用24～72 h后，NCI-H446細胞增殖均受到不同程度的抑制（見圖1）。根據(jù)K?rber法，24 h姜黃素的半數(shù)抑制濃度（IC50）為224.5μg／mL，48 h的 IC50為64.3μg／mL。選取48 h NCI-H446細胞抑制率為20%～30%的姜黃素濃度（20μmol／L）進行后續(xù)試驗。

圖1 不同濃度姜黃素對NCI-H446細胞的生長抑制作用Fig.1 Effect of different concentration of curcumin on the viability of NCI-H446 cell

2.2 不同劑量X射線對NCI-H446細胞增殖的影響 當輻射強度在12 Gy以內時，隨著射線強度的增加以及照射時間的延長，對NCI-H446細胞的抑制率也進一步增加（見圖2）。24 h輻射的IC50為18.4Gy，48 h的IC50為14.8Gy，選取抑制率為20%～30%時的輻射劑量（8 Gy）用于下一步實驗。

圖2 不同強度X線對NCI-H446細胞的生長抑制作用Fig.2 Effect of different intensity of X-ray on the viability of NCI-H446 cell

2.3 姜黃素對NCI-H446細胞的放射增敏作用 MTT結果顯示：8Gy X射線組處理48 h時對NCI-H446細胞生長抑制率為（27.8±3.4）%。分別用 5、10、20μmol／L濃度姜黃素聯(lián)合干預后，肺癌NCI-H446細胞的增殖抑制率隨著姜黃素濃度的增加逐漸升高，與單用姜黃素組、X射線組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，見圖3）。

圖3 不同強度X線和姜黃素對NCI-H446細胞的生長抑制作用**P＜0.01，與20μmol／L姜黃素相比；＃＃P＜0.01，與8 Gy X-射線相比Fig.3 Effect of different intensity of X-ray and curcumin on the viability of NCI-H446 cell**P＜0.01，compared with 20μmol／L curcumin；＃＃P＜0.01，compared with 8Gy X-ray

2.4 姜黃素聯(lián)合X射線對NCI-H446細胞凋亡的影響 流式細胞術結果顯示：盡管姜黃素處理48 h和8 Gy X射線處理均可促進NCI-H446細胞凋亡，但2者聯(lián)合處理后，隨著姜黃素濃度的遞增，凋亡抑制率逐漸增高，與單用20μmol／L姜黃素或8Gy射線相比，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見圖4）。

圖4 不同強度X線和姜黃素對NCI-H446細胞凋亡的影響*P＜0.05，與 20μmol／L姜黃素相比；＃P＜0.05，與 8Gy X-射線相比Fig.4 Effect of different intensity of X-ray and curcumins on NCI-H446*P＜0.05，compared with 20μmol／L curcumin；*P＜0.01，compared with 8 Gy X-ray

2.5 凋亡相關蛋白含量檢測 Western結果顯示放射線及姜黃素均能增加NCI-H446細胞p53、p21、Bax和Bcl-2蛋白的表達（P＜0.05）。而 2者聯(lián)合使用后，p53、p21、Bcl-2／Bax比值比單獨應用的表達上升，作用顯著（P＜0.01，見圖5）。

圖5 不同強度X線和姜黃素對NCI-H446細胞凋亡基因表達的影響1.20μmol／L姜黃素；2.8 Gy X射線；3.8 Gy X射線 ＋5μmol／L姜黃素；4.8 Gy X射線 ＋10μmol／L姜黃素；5.8Gy X射線 ＋20μmol／L姜黃素*P＜0.05，與 X-ray組相比Fig.5 Effect of different intensity of X-ray and curcumin on apoptosis genes of the NCI-H4461.20μmol／L curcumin；2.8 Gy X-ray；3.8 Gy X-ray＋5μmol／L curcumin；4.8Gy X-ray＋10μmol／L curcumin；5.8Gy X-ray＋20μmol／L curcumin*P＜0.05，compared with X-ray group

3 討論

放療是肺癌的重要輔助治療方式。早在上個世紀五六十年代就有研究發(fā)現(xiàn)一些硝基咪唑類化合物可有效增強放療的效果，但由于其神經(jīng)毒性太大而未能廣泛應用于臨床。隨后又發(fā)現(xiàn)甲硝唑等一些化療藥物也能產(chǎn)生增敏效果，但依然因為不良反應太大而使其應用受到了限制［7-8］。因此尋求低毒的放療增敏劑，對于肺癌的治療非常重要。近年來姜黃素在腫瘤中的應用受到眾多學者的關注。藥理學研究表明，姜黃素具有明確的抗腫瘤效應，包括影響細胞周期、誘導細胞凋亡、抑制血管發(fā)生、降低腫瘤細胞遷移與侵襲相關酶類的表達，并對耐藥性腫瘤細胞有一定的逆轉作用［9-10］。以上藥理作用是本研究選擇姜黃素用于放療增敏劑的重要理論依據(jù)。

本研究首先通過MTT法對X射線和姜黃素作為單獨處理因素對NCI-H446細胞增殖與凋亡進行了探討。結果表明姜黃素能以劑量和時間依賴性方式抑制NCI-H446細胞生長增殖。與姜黃素類似，X射線的一定劑量下，也具有類似的抑制效應。隨后根據(jù)姜黃素或X射線對細胞抑制率為20%～30%的濃度進行了聯(lián)合干預，結果顯示，在X射線強度一致的情況下，細胞增殖抑制率以及凋亡率隨姜黃素濃度的增高而增加，較單純X射線或單純藥物處理差異有統(tǒng)計學意義。初步顯示出了姜黃素對小細胞肺癌NCI-H446細胞的放療增敏效應。

為進一步探討姜黃素與放療誘導NCI-H446細胞凋亡的機制，本研究對抑癌基因p53和p21進行了檢測。細胞內p53蛋白是最重要的抑癌基因，尤其是在修復DNA完整性方面發(fā)揮重要作用，防止癌變細胞的發(fā)生［11］。p21是位于p53基因下游的細胞周期素依賴性激酶抑制因子，與p53共同構成細胞周期檢測點，從而阻滯細胞進行正常有絲分裂，減少受損DNA復制，抑制細胞惡性增殖［12］。本研究證實，姜黃素和放療均可增加NCIH446細胞中的p53和p21蛋白的含量，2者聯(lián)合處理后，它們的表達量與單純X射線與姜黃素處理相比增加更顯著（P＜0.01）。由此推測姜黃素對肺癌細胞的放療增敏作用可能與上調抑癌基因p53和p21蛋白表達有關。

腫瘤治療的最終目標是誘導其凋亡，在參與凋亡的眾多調節(jié)蛋白中，Bcl-2基因家族發(fā)揮著重要作用。Bax是該家族中重要的促凋亡蛋白，其可與Bcl-2結合形成異二聚體，從而抑制Bcl-2活性。通常以 Bcl-2／Bax的比值來反應細胞凋亡情況［13-15］。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，姜黃素或放射組細胞中Bcl-2蛋白含量明顯減少，Bax蛋白含量明顯增加（P＜0.05）。姜黃素與放射聯(lián)合處理后，NCI-H446細胞中Bcl-2／Bax比值明顯降低（P＜0.01）。

綜上所述，本研究證實姜黃素對肺癌NCI-H446細胞具有一定的放療增敏作用。其增敏機制可能與誘導細胞凋亡、以及上調p53、p2l蛋白表達、下調Bcl-2／Bax的比率有關。但具體的分子生物學機制還有待后續(xù)進一步研究。

［1］ Ganti AK，Subbiah SP，Kessinger A，etal.Association between race and survival of patients with non--small-cell lung cancer in the United States veterans affairs population［J］.Clin Lung Cancer，2014，15（2）：152-158.

［2］ Lammers PE，Horn L.Targeting angiogenesis in advanced non-small cell lung cancer［J］.J Natl Compr Canc Netw，2013，11（10）：1235-1247.

［3］ Passaro A，Trenta P，Conte D，et al.The impact of chemotherapy on the lymphatic system in thoracic oncology［J］.Thorac Surg Clin，2012，22（2）：243-249.

［4］ Dranitsaris G，Beegle N，Ravelo A，et al.Evaluating the impact of bevacizumab maintenance therapy on overall survival in advanced nonsmall-cell lung cancer［J］.Clin Lung Cancer，2013，14（2）：120-127.

［5］ Genova C，Rijavec E，Barletta G，et al.Afatinib for the treatment of advanced non-small-cell lung cancer［J］.Expert Opin Pharmacother，2014，15（6）：889-903.

［6］ Fouladbakhsh JM，Davis JE，YarandiHN.A pilotstudy of the feasibility and outcomes of yoga for lung cancer survivors［J］.Oncol Nurs Forum，2014，41（2）：162-174.

［7］ Zhang X，Cheung RM，Komaki R，et al.Radiotherapy sensitization by tumor-specific TRAIL gene targeting improves survival ofmice bearing human non-small cell lung cancer［J］.Clin Cancer Res，2005，11（18）：6657-6668.

［8］ Friedman GD，Selby JV.Epidemiological screening for potentially carcinogenic drugs［J］.Agents Actions Suppl，1990，29：83-96.

［9］ Ye MX，Li Y，Yin H，et al.Curcumin：updated molecular mechanisms and intervention targets in human lung cancer［J］.Int JMol Sci，2012，13（3）：3959-3978.

［10］ Cheng KW，Wong CC，Mattheolabakis G，etal.Curcumin enhances the lung cancer chemopreventive efficacy of phospho-sulindac by improving its pharmacokinetics［J］.Int JOncol，2013，43（3）：895-902.

［11］ Puri N，Pitman RT，Mulnix RE，et al.Non-small cell lung cancer is susceptible to induction of DNA damage responses and inhibition of angiogenesis by telomere overhang oligonucleotides［J］.Cancer Lett，2014，343（1）：14-23.

［12］ Shoji T，Tanaka F，Takata T，et al.Clinical significance of p21 expression in non-small-cell lung cancer［J］.J Clin Oncol，2002，20（18）：3865-3871.

［13］ Stark AM，Hugo HH，Tscheslog H，et al.p53，BCL-2 and BAX in nonsmall cell lung cancer brainmetastases：a comparison of real-time RTPCR，ELISA and immunohistochemical techniques［J］.Neurol Res，2007，29（5）：435-440.

［14］ Yaren A，Oztop I，Kargi A，et al.Bax，bcl-2 and c-kit expression in non-small-cell lung cancer and their effects on prognosis［J］.Int JClin Pract，2006，60（6）：675-682.

［15］ Amoedo ND，Castelo-Branco MT，Paschoal ME，et al.Expression of ABC transporters，p53，Bax，Bcl-2 in an archival sample of non-small cell lung cancer bearing a deletion in the EGFR gene［J］.Int JMol Med，2009，23（5）：609-614.

（編校：吳茜）

Radiotherapy sensitization role of curcum in on lung cancer cells and itsmechanism

LIN Qing-ren，ZHOU XiaΔ

（Department of Radiotherapy，Tumor Hospital of Zhejiang Province，Hangzhou 310022，China）

ObjectiveTo observe the radiosensitizing effect of curcumin on lung cancer NCI-H446 cell in vitro and to investigate the possible mechanism.MethodsLung cancer NCI-H446 cell were cultured in vitro and divided into four groups：control group，curcumin group，X-ray group and combined intervention group.Control group was given equal volume ofmedium，curcumin group was treated with 20μmol／L curcumin for 48 h，X-ray group was irradiated by X-ray（dose rate was 250 cGy／min）and combined intervention group was treated with curcumin and X-ray.The proliferation of NCI-H446 cell in all groupswere detected by MTTmethod，cell apoptosiswere detected by flow cytometry and the protein expression of p53，p21，Bax，Bcl-2 were detected by Western blot.ResultsThe growth of human lung cancer NCI-H446 cellwere inhibited with different concentrations of curcumin and 6～12 Gy X-ray irradiation，and inhibited more in combined intervention group，in curcumin dose-dependentmanner.Flow cytometry results showed that，curcumin or X-ray irradiation could all induce apoptosis，the cell apoptosis increaced significantly when treated with both（P＜0.05）.Western blot results showed that，either curcumin or X-rays could induce p53，p21 and Bax protein expression in NCI-H446 cell and decrease Bcl-2 protein expression（P＜0.05）.After the combination of X-rays and curcumin，the content of p53，p21，Bax and Bcl-2 protein was significantly changed（P＜0.05）.ConclusionCurcumin has radiosensitizing effect on lung cancer NCI-H446 cell.The mechanism is connected with the inducing of apoptosis，increasing p53，p21 protein expression and decreasing the Bcl-2／Bax ratio.

curcumin；lung cancer cell；radiotherapy

R735

A

1005－1678（2014）05－0033－04

肺癌是威脅人類生命和健康最嚴重的惡性腫瘤之一。美國2013年最新數(shù)據(jù)顯示，肺癌死亡病例達58萬，居腫瘤病死亡率的首位［1］。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是最常見的病理類型（約占80%以上）。目前對于早期NSCLC，手術依然是主要的治療手段，但對于無法進行手術或無法治愈的NSCLC而言，放射治療是重要的輔助治療手段［2］。放射治療可提高腫瘤的局部控制率，但依然受多種因素限制：①NSCLC患者往往機體抵抗力差，對放療劑量耐受性低［3］；②放療受腫瘤的組織學類型的影響；③病灶周圍正常組織也無法耐受大劑量的放療。放療聯(lián)合抗腫瘤藥物可提高臨床療效，但不良反應依然是臨床上面臨的主要問題［4-5］。因此尋求不良反應少，且能有效提高放療療效的藥物，是一種非常有前途的方案。近年來研究發(fā)現(xiàn)許多中草藥提取物可有效提高腫瘤細胞對放療的敏感性，姜黃素就是其中一種［6］。本研究旨在觀察姜黃素對肺癌NCI-H446細胞的放療增敏作用，探討其可能的作用機制。

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生平臺骨干人才計劃（2011RCB008）

林清認，男，碩士，住院醫(yī)師，研究方向：腫瘤放射治療，E-mail：linqingren1984＠163.com；周霞，通信作者，女，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤放射治療，E-mail：zhouxia197612＠163.com。