膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I405V多態(tài)位點(diǎn)與辛伐他汀對(duì)血脂異常患者調(diào)脂療效的關(guān)聯(lián)性

壽峰勤，金軼，楊小英

（1.紹興市第六人民醫(yī)院 肝三科，浙江 紹興 312000；2.成都市第三人民醫(yī)院蒲江醫(yī)院 內(nèi)科，四川 成都 611630）

膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I405V多態(tài)位點(diǎn)與辛伐他汀對(duì)血脂異?；颊哒{(diào)脂療效的關(guān)聯(lián)性

壽峰勤1，金軼1，楊小英2

（1.紹興市第六人民醫(yī)院 肝三科，浙江 紹興 312000；2.成都市第三人民醫(yī)院蒲江醫(yī)院 內(nèi)科，四川 成都 611630）

目的探究膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（cholesteryl ester transfer protein，CETP）基因內(nèi)的I405V（rs5882）單核苷酸多態(tài)性與辛伐他汀對(duì)血脂異?；颊哒{(diào)脂療效的關(guān)聯(lián)性。方法本研究納入375例血脂異?；颊撸捎肧NaPshotTM引物延伸方法檢測(cè)CETP I405V位點(diǎn)的基因型信息。在辛伐他汀治療開(kāi)始前和治療6周后記錄患者的各類(lèi)血脂水平，比較分析治療效果和I405V多態(tài)位點(diǎn)基因型之間的相關(guān)性。結(jié)果I405V位點(diǎn)II、IV、VV的基因型頻率分別為12.5%，48.5%，38.9%。6周辛伐他汀治療后，患者的血清總膽固醇（total cholesterol，TC）水平下降了 1.21 mmol／L，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平上升了0.74mmol／L（P＜0.01）。I405 V多態(tài)位點(diǎn)II基因型的TC水平下降幅度比IV和VV基因型分別高出0.26mmol／L和0.16mmol／L，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。HDL-C水平的上升幅度在3類(lèi)基因型間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），II型的上升幅度為0.85mmol／L，比 IV，VV型 HDL-C水平上升幅度分別高出0.09mmol／L，0.15mmol／L。結(jié)論CETP基因內(nèi)的I405 V（rs5882）單核苷酸多態(tài)性與辛伐他汀調(diào)節(jié)血脂效果類(lèi)似，II等位基因患者經(jīng)辛伐他汀治療后血脂下降水平顯著高于含V等位基因患者，提示該位點(diǎn)可能是預(yù)測(cè)血脂異?；颊咝练ニ≈委熜Ч麄€(gè)體化差異的標(biāo)志物。

單核苷酸多態(tài)性；辛伐他汀；膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；總膽固醇；高密度脂蛋白膽固醇

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取在浙江省紹興市第六人民醫(yī)院住院的375例無(wú)血緣關(guān)系的血脂異常患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）滿(mǎn)足以下診斷標(biāo)準(zhǔn)中任一條，TC＞6.22 mmol／L，LDL-C＞4.14 mmol／L，HDL-C＜1.04mmol／L，TG＞2.26mmol／L［7］；（2）住院前6周內(nèi)無(wú)調(diào)脂藥物服藥史。排除標(biāo)準(zhǔn)：冠心病、肝腎功能不全、近期感染史和腫瘤手術(shù)史者；有他汀藥物過(guò)敏史者；孕婦和哺乳期婦女。納入研究的所有患者，住院后第2日開(kāi)始辛伐他汀（北京萬(wàn)生藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào) H20000488）調(diào)脂治療，劑量為每日20 mg，持續(xù)6周。所有患者均已經(jīng)相關(guān)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 血液采集、血脂水平測(cè)定與DNA的提取 入院時(shí)取患者清晨空腹外周靜脈血10mL，經(jīng)枸櫞酸鈉抗凝處理保存。分裝5ml血液立即在BECKMAN SYNCHRON-LX20全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó) Avanti polar lipids）上完成主要血脂指標(biāo) TC，TG，VLDL-C，LDL-C，HDL-C的測(cè)定［8］。剩余 5mL血液 4℃保存，并在10d內(nèi)使用碧云天基因組DNA小量抽提試劑盒進(jìn)行DNA抽提。6周辛伐他汀藥物治療結(jié)束第2天，同條件取外周靜脈血5mL，血脂指標(biāo)測(cè)定方法一致。

1.3 CETP基因I405V多態(tài)位點(diǎn)基因型分析

1.3.1 CETP基因目的片段擴(kuò)展 在NCBI網(wǎng)站下載CETP基因的Reference Sequence：NG_008952.1。利用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR擴(kuò)增引物，并在上海捷瑞公司合成。PCR擴(kuò)增上游引物：5’-CTCACCATGGGCATT TGATTGCAGAGCAGCTCCGACTCC-3’，下游引物：3’-AAAGGTGAAATGGGAAGCTCTGTCAGCCTCGG-5’。50μL PCR擴(kuò)增體系為：10×PCR緩沖液（含 Mg2＋）5.0μL，2.5mmol／L dNTP 4μL，10μmol／L正向和反向引物1μL，Tap酶0.5μL，Sigma去離子水38.5μL，DNA模板1μL。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)參數(shù)：94℃變性10 s，57℃退火15 s，72℃延伸30 s，32個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。

1.3.2 SNaPshotTM基因分型 （1）擴(kuò)增產(chǎn)物純化：取1μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入2.0 U堿性磷酸酶（Fermentas公司），2.0 U ExonI酶（Fermentas公司），去離子水5μL，反應(yīng)總體系為10μL，混勻后37℃反應(yīng)80min，80℃反應(yīng)15 min使酶失活。（2）延伸PCR：根據(jù)CETP基因參考序列，參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)延伸PCR引物：5’-TTTTTTGACTGCAGGAAGCTCTGGA-3’［9］，6μL應(yīng)體系包括：純化PCR產(chǎn)物1μL，5×Seq緩沖液1.2μL，SnaPshotMultiplex Mix（美國(guó)ABI公司）1.0μL，去離子水 2μL，延伸引物終濃度為0.2μmol／L。延伸PCR程序：1196℃預(yù)變性2min；2296℃解鏈10 s；3355℃退火5 s；4460℃延伸30 s，22-44共24個(gè)循環(huán)。（3）延伸PCR產(chǎn)物純化：1U蝦堿性磷酸酶和PCR產(chǎn)物混合后置于37℃1 h，80℃反應(yīng)15 min使酶失活。（4）基因分型與數(shù)據(jù)讀?。喊匆髮?μL延伸PCR純化產(chǎn)物放入96孔板，每個(gè)體系加入 Hi-Di甲酰胺（ABI）9μL，LIZ-120（ABI）0.22μL，混勻離心后，95℃變性5min，立即置冰上5min。在ABI公司基因分析儀3130機(jī)器進(jìn)行樣本讀取，使用GeneMaper V3.0進(jìn)行基因分型數(shù)據(jù)分析［10］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)以“x±s”表示，治療前后各類(lèi)血脂水平比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。用χ2檢驗(yàn)法分析Hardy-Weinberg遺傳平衡。2組間基因型與等位基因頻率采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。對(duì)3組基因型患者治療前后的血脂變化量做單因素方差分析、Post Hoc多重比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 納入患者的基本臨床資料 375例血脂異?；颊咧心行?00例，女性175例，平均年齡（57±14），平均體質(zhì)量指數(shù)（29±3）kg／m2，有高血壓患者 125例，無(wú)高血壓患者 250例，飲酒患者52例，無(wú)飲酒患者325例。

2.2 CETP基因I405V多態(tài)位點(diǎn)基因型分析 各組基因型患者數(shù)為 VV（n＝47），IV（n＝182），II（n＝146），基因型頻率分別為12.5%，48.5%，38.9%。等位基因V的頻率為0.368，等位基因I的頻率為0.632。Hardy-Weinberg遺傳平衡卡方檢驗(yàn)：χ2＝0.70，P＝0.40。

2.3 辛伐他汀治療前后所有患者主要血脂指標(biāo)變化分析

375例血脂異?；颊呔瓿?周辛伐他汀治療，結(jié)果見(jiàn)表1。辛伐他汀治療6周后，患者TC水平顯著下降（P＜0.01），HDL-C水平顯著上升（P＜0.01）。

表1 治療前后血脂指標(biāo)結(jié)果變化比較（mmol／L）Tab.1 Comparisons of Blood fat indexes before and after treatment with simvastatin for 6 weeks（mmol／L）

2.4 辛伐他汀治療前I405V多態(tài)位點(diǎn)不同基因型人群主要血脂指標(biāo)分析 結(jié)果顯示，IV基因型組的TG水平比II，VV基因型組分別高出了0.1mmol／L，0.23mmol／L，此結(jié)果顯示 TG水平在各基因組間有一定差異的趨勢(shì)（P＝0.052），TC、HDL-C、LDL-C與VLDL-C的比較結(jié)果在各基因型組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)表2）。

表2 治療前3類(lèi)基因型血脂指標(biāo)結(jié)果（mmol／L）Tab.2 Blood fat indexes profile in 3 genotypes before treatment（mmol／L）

2.5 辛伐他汀治療后I405V多態(tài)位點(diǎn)不同基因型人群主要血脂指標(biāo)變化 辛伐他汀治療后，I405V位點(diǎn)為II型人群的TC下降幅度為1.27mmol／L，顯著高于IV、VV基因型組人群的下降幅度（F＝6.52，P＜0.01）。II型人群HDL-C的上升幅度為0.85mmol／L，比 IV、VV型 HDL-C水平上升幅度分別高出0.09mmol／L和0.15mmol／L（F＝8.75，P＜0.01）。TG，LDL-C，VLDL-C，在3組基因型中都有下降，但組間的下降幅度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)表3）。2.6 按BMI分組后不同基因型人群主要血脂指標(biāo)變化

表3 治療前后3類(lèi)基因型血脂變化比較（mmol／L）Tab.3 Change profile of blood fat indexes in 3 genotypes of I405V（mmol／L）

將血脂異?；颊甙碆MI水平分成2組，在18.5～23.9 kg／m2范圍為正常體質(zhì)量（155例患者）；≥24.0 kg／m2為超重和肥胖（220例患者）［7］，分別對(duì)BMI分組的各基因型患者的血脂水平變化量進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，正常體質(zhì)量患者II基因型患者的TC水平下降幅度仍然高于IV、VV基因型患者（P＜0.01），但3者之間HDL-C上升幅度差異消失。超重和肥胖患者II基因型患者的TC水平下降幅度仍然高于IV、VV基因型組（P＜0.05）。同時(shí)II基因型患者的HDL-C水平上升幅度仍然高于IV、VV基因型組（P＜0.05，見(jiàn)表4）。

表4 不同BMI 3類(lèi)基因型血脂指標(biāo)變化比較（mmol／L）Tab.5 Change profile of blood fat indexes in 3 genotypes of I405V according to different BMIgroups（mmol／L）

2.7 藥物不良反應(yīng)結(jié)果 辛伐他汀治療6周期間，3組基因型患者發(fā)生輕微的消化道異常、肝功能損傷、肌肉癥狀等不良反應(yīng)。

3 討論

血脂異常多為遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，調(diào)脂治療即使對(duì)同一類(lèi)型的血脂異?；颊咭泊嬖诿黠@的治療效果個(gè)體差異［11］。

國(guó)內(nèi)外已有成果探討了CETP基因多態(tài)性與他汀藥物治療效果的比較，其中TaqlB多態(tài)性與他汀藥物治療效果的研究相對(duì)較多，但結(jié)果尚有爭(zhēng)議［12-14］。CETP I405V是一個(gè)功能性位點(diǎn)，該位點(diǎn)突變可導(dǎo)致膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白的第405位氨基酸由異亮氨酸變?yōu)槔i氨酸，使CETP活性下降，從而升高HDL-C水平［15］。

本實(shí)驗(yàn)中，375例血脂異?；颊呓?jīng)6周辛伐他汀治療后，血脂異?；颊哐錞C水平顯著降低（P＜0.01），同時(shí)HDL-C水平顯著升高（P＜0.01）。CETP I405 V位點(diǎn)為II型人群的TC下降幅度為1.27mmol／L，顯著高于IV、VV基因型組人群的下降幅度（P＜0.01）。II型人群 HDL-C的上升幅度為 0.85 mmol／L，比IV、VV型 HDL-C水平上升幅度分別高出 0.09 mmol／L和0.15mmol／L（P＜0.01）。1405 V位點(diǎn)各基因型患者在辛伐他汀治療前的各項(xiàng)血脂水平?jīng)]有顯著性差異，只有TC水平有一定的差異趨勢(shì)。這可能因?yàn)闃颖玖刻?，?dǎo)致差異不能被檢測(cè)，也提示I405 V多態(tài)影響辛伐他汀療效的機(jī)制可能與治療前血脂水平無(wú)關(guān)。對(duì)患者按是否肥胖分組后，TC水平下降的幅度在正常體重組和超重或肥胖組各基因型組間差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但HDL-C水平升高的幅度只在超重或肥胖組患者各基因型患者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。目前CETP影響辛伐他汀療效的具體機(jī)制并不明確，本研究發(fā)現(xiàn)CETP I405V等位基因型者有更好的降低TC，升高HDL-C水平的治療效果，這一結(jié)果提示，CETP I405V多態(tài)位點(diǎn)II基因型患者較之IV和VV基因型患者，對(duì)辛伐他汀調(diào)脂作用的敏感性更高，這一結(jié)論與劉晉秦等［16］在北京地區(qū)血脂異常患者中得出的結(jié)論基本一致。此外，相對(duì)于正常體重血脂異常人群，本研究還發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象在超重或肥胖的血脂異常患者中更明顯。

綜上所述，II基因型患者較之IV和VV基因型患者，對(duì)辛伐他汀調(diào)脂作用的敏感性更高，具體機(jī)制需要進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。但由于本試驗(yàn)僅選取了一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，樣本量也比較小，有一定的局限性。后續(xù)研究中，會(huì)通過(guò)增加CETP中的多態(tài)位點(diǎn)，增加樣本量等展開(kāi)更多相關(guān)性研究來(lái)證實(shí)CETP多態(tài)性對(duì)他汀類(lèi)藥調(diào)脂效果的影響。

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（編校：李璐璐）

The correlation between 1405V polymorphism in CETP gene and therapeutic effect of sim vastatin in dyslipidem ia patients

SHOU Feng-qin1，JIN Yi1，YANG Xiao-ying2

（1.Department of Hepatology，The Sixth People’s Hospital of Shaoxing，Zhejiang 312000，China；2.Department of Internal Medicine，The Third People’s Hospital of Chengdu，Sichuan 611630，China）

ObjectiveTo investigate the correlation between I405 single nucleotide polymorphism in CETP gene and the therapeutic effect of simvastatin in dyslipidemia patients.MethodsGenotype information of I405V in CETP gene was detected by SNaPshotTMprimer extension assay in 375 dyslipidemia patients.Blood lipid profiles before and 6 weeks after treatment with simvastatin were recorded to analyze the correlation between the therapeutic effect of simvastatin and I405 polymorphism genostype.ResultsThe frequency of I405 V polymorphism was 38.9%in II genotype，48.5%in IV genotype and 12.5%in VV genotype.After being treated with simvastatin for 6 weeks，the serum levels of TC were significantly decreased by 1.21 mmol／L（P＜0.01）and HDL-C level was significantly increased by 0.74 mmol／L（P＜0.01）.Compared with the IV and VV genotypes of I405V polymorphism，the decrease of TC in IIgenotype patientswere 0.26mmol／L and 0.16mmol／Lmore respectively（P＜0.01）.Meanwhile，the increase of HDL-C was significantly different among three genotypes（P＜0.01）.HDL-C in II genotype was increased by 0.85mmol／L，which was 0.19mmol／L and 0.15mmol／Lmore compared with IV genotype and VV genotype，respectively.ConclusionI405V polymorphism in CETP gene is similar with the lipidregulating effect of simvastatin.The decrease of blood lipid ismore significant in patientswith IIgenotype compared with patientswith V allele，suggesting that IIgenotype is themaker whichmay predict the therapeutic effectof simvastatin in dyslipidemia patients.However，this conclusion still needs further evaluation.

single nucleotide polymorphism；simvastatin；cholesteryl ester transfer protein；total cholesterol；high density lipoprotein cholesterol

R972＋.6

A

1005－1678（2014）03－0048－04

血脂異常與動(dòng)脈粥樣硬化以及其他心血管事件的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。近年來(lái)，隨著生活水平的提高，我國(guó)人群血清膽固醇水平和心血管事件發(fā)生率也呈顯著的上升趨勢(shì)［1］。辛伐他汀可以降低患者的血清總膽固醇（total cholesterol，TC）水平，同時(shí)升高高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平，是臨床上血脂異?；颊叩某Ｓ盟幬?，但在治療效果上有顯著的個(gè)體化差異［2］。環(huán)境因素，遺傳因素以及環(huán)境和遺傳的相互作用會(huì)共同作用于藥物療效［3］。膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白由CETP（cholesteryl ester transfer protein）編碼，在調(diào)節(jié)血漿高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）水平和重塑HDL顆粒組成方面發(fā)揮著重要作用，是HDL和低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）水平的主要決定因素之一［4］，研究證實(shí)CETP抑制劑能夠有效的升高血漿HDL-C水平，因此也被認(rèn)為是影響辛伐他汀藥效的敏感基因之一［5］。I405V（rs5882）多態(tài)位點(diǎn)為CETP基因第14號(hào)外顯子第405位密碼子A堿基-G堿基的突變，導(dǎo)致異亮氨酸（IIe）突變成纈氨酸（Val）。研究顯示這一位點(diǎn)與CETP低表達(dá)，HDL-C水平升高相關(guān)［6］。本研究對(duì)中國(guó)人群CETP內(nèi)I405V單核苷酸多態(tài)性與辛伐他汀調(diào)節(jié)血脂療效進(jìn)行分析，為臨床合理用藥提供參考信息。

四川省醫(yī)藥衛(wèi)生計(jì)劃項(xiàng)目（2011KYB154）

壽峰勤，女，本科，護(hù)師，研究方向：對(duì)血脂異?；颊哒{(diào)脂相關(guān)研究，E-mail：shoufengqin2222＠163.com