頭孢曲松和亞胺培南對膿毒癥大鼠腸道菌群及細(xì)菌耐藥性的影響

邊金洞，周祖模，張?zhí)K江

（1.諸暨市人民醫(yī)院 感染內(nèi)科，浙江 諸暨 311800；2.江蘇省人民醫(yī)院 感染科，江蘇 南京 210029）

頭孢曲松和亞胺培南對膿毒癥大鼠腸道菌群及細(xì)菌耐藥性的影響

邊金洞1，周祖模1，張?zhí)K江2

（1.諸暨市人民醫(yī)院 感染內(nèi)科，浙江 諸暨 311800；2.江蘇省人民醫(yī)院 感染科，江蘇 南京 210029）

目的探討頭孢曲松和亞胺培南對膿毒癥大鼠腸道各種菌類數(shù)量以及細(xì)菌耐藥性的影響。方法從48只健康SD大鼠中隨機(jī)抽取8只為正常對照組，其余40只按照15mg／kg腹腔注射內(nèi)毒素的方式建立內(nèi)毒素膿毒癥模型；根據(jù)建模后24 h是否應(yīng)用抗生素以及抗生素應(yīng)用時(shí)限再將40只內(nèi)毒素膿毒癥模型鼠細(xì)分為膿毒癥未治療組、膿毒癥頭孢曲松3 d組、膿毒癥頭孢曲松7 d組、膿毒癥亞胺培南3 d組和膿毒癥亞胺培南7 d組（n＝8）。在用頭孢曲松和亞胺培南腹腔注射治療期間，在給藥第3 d和第7 d后分別取大腸內(nèi)容物進(jìn)行腸道桿菌、腸球菌和真菌的定量培養(yǎng)和細(xì)菌的菌種鑒定。結(jié)果用抗生素治療后，2組大鼠腸道優(yōu)勢菌大腸桿菌和糞腸球菌數(shù)量均顯著減少（P＜0.05），頭孢曲松選擇出銅綠假單胞菌和陰溝桿菌，亞胺培南選擇出肺炎克雷伯桿菌、變形桿菌和屎腸球菌等條件致病菌，均表現(xiàn)出耐藥傾向。結(jié)論頭孢曲松和亞胺培南抗生素可引起原籍菌群數(shù)銳減，銅綠假單胞菌和屎腸球菌等條件致病菌成為優(yōu)勢菌群，引發(fā)腸道微生態(tài)環(huán)境紊亂。

頭孢曲松；亞胺培南；大鼠；膿毒癥；耐藥性

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的制備與分組 健康雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量220～250 g，由上海西普爾－必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［動(dòng)物許可證號，SCXK（滬）2011—0028］。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，禁食不禁水12 h。48只大鼠隨機(jī)分為6組，每組8只，隨機(jī)選取1組設(shè)為正常對照組，其余5組均按照15mg／kg腹腔注射內(nèi)毒素建立膿毒癥模型后再隨機(jī)分為膿毒癥未治療組（不給予治療）、膿毒癥頭孢曲松3 d組（即采用頭孢曲松治療3 d后）、膿毒癥頭孢曲松7 d組（即采用頭孢曲松治療7 d后）、膿毒癥亞胺培南3 d組（即采用亞胺培南治療3 d后）和膿毒癥亞胺培南7 d組（即采用亞胺培南治療7 d后）。在內(nèi)毒素注射24 h后，膿毒癥頭孢曲松3 d組和7 d組給予頭孢曲松（羅氏芬，上海羅氏制藥有限公司，批號H10983036），膿毒癥亞胺培南3 d組和7 d組給予亞胺培南（泰能，杭州默沙東制藥有限公司，批號H20040508）治療，劑量均為120mg／kg，2種抗生素的給藥方式均分為2次間隔12 h腹腔注射。在相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)分別將各組大鼠活殺，并在無菌條件下采集標(biāo)本。

1.2 指標(biāo)檢測 無菌條件下打開腹腔，切開大腸壁，取其內(nèi)容物，約0.5 g，以生理鹽水10倍稀釋為原液，取原液進(jìn)行1∶10、1∶100、1∶1 000倍比稀釋，根據(jù)各菌群所需培養(yǎng)液成分的不同，分別取100μL原液梯度稀釋液涂布于哥倫比亞血瓊脂平板（主要用于分離培養(yǎng)腸道彎曲菌、幽門螺桿菌等）、麥康凱平板（主要用于分離培養(yǎng)革蘭陰性腸道桿菌）、腸球菌平板（主要用于分離培養(yǎng)腸球菌）備用。上述標(biāo)本梯度稀釋液分別做3個(gè)平板，并置于37℃ CO2孵箱培養(yǎng)24 h，后依次統(tǒng)計(jì)各平板菌落數(shù)，并計(jì)算3個(gè)梯度的菌落平均數(shù)。根據(jù)下列公式對細(xì)菌進(jìn)行定量分析：組織細(xì)菌量（cfu／g）＝菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)／組織重量。根據(jù)菌落形態(tài)和革蘭染色進(jìn)行初步鑒定，再由細(xì)菌自動(dòng)分析儀進(jìn)行菌落鑒定。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS16.0軟件進(jìn)行，正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)以“x±s”表示，多組間單變量對比使用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 頭孢曲松和亞胺培南對膿毒癥大鼠腸道桿菌、腸球菌和真菌數(shù)量的影響 對測算所得細(xì)菌數(shù)目均做對數(shù)轉(zhuǎn)換，以便進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。對數(shù)轉(zhuǎn)換的底設(shè)為10。由表1可知膿毒癥未治療組3種菌落數(shù)均高于正常對照組，應(yīng)用頭孢曲松治療后，3 d組桿菌數(shù)量明顯降低，與正常對照組和膿毒癥未治療組相比差異顯著（P＜0.01），與3 d組類似，7 d組桿菌數(shù)量較少，與正常對照組無顯著差異，而與膿毒癥未治療組差異顯著（P＜0.05）。頭孢曲松治療后，3 d組與7 d組腸球菌數(shù)量均顯著高于正常對照組和膿毒癥未治療組（P＜0.01）。分析真菌數(shù)量發(fā)現(xiàn)，3 d組與正常對照組差異顯著（P＜0.01），而與膿毒癥未治療組無顯著差異；同樣，7 d組與正常對照組差異顯著（P＜0.05），而與膿毒癥未治療組無顯著差異。

亞胺培南治療后，3 d組桿菌數(shù)量與正常對照組和膿毒癥未治療組均無顯著差異，而7 d組與正常對照組相比差異顯著（P＜0.05）。而亞胺培南治療后3 d組和7 d組均顯著高于正常對照組和膿毒癥未治療組（P＜0.01）。分析真菌檢出數(shù)量發(fā)現(xiàn)，治療后3 d組和7 d組真菌數(shù)量增多，顯著高于正常對照組（P＜0.05），而與未治療組無顯著差異。

表1 頭孢曲松、亞胺培南對大鼠腸道3種類型菌的數(shù)量的影響（lg cfu／g）Tab.1 Effects of ceftriaxone and imipenem on the three types of bacterial（lg cfu／g）

2.2 頭孢曲松和亞胺培南對膿毒癥大鼠腸道細(xì)菌種類的影響

2.2.1 頭孢曲松對大鼠腸道細(xì)菌種類的影響 由表2可知，正常對照組中僅檢出大腸桿菌和糞腸球菌。而膿毒癥未治療組中，新檢出少量肺炎克雷伯桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和變形桿菌，大腸桿菌和糞腸球菌仍保持優(yōu)勢菌種地位。頭孢曲松治療后3 d組，大腸桿菌和糞腸球菌數(shù)量減少，其中糞腸球菌檢出率由100%減為50%。同時(shí)檢出少量屎腸球菌，銅綠假單胞菌檢出率為62.5%。頭孢曲松治療后7 d組中大腸桿菌數(shù)量明顯降低，檢出率僅為25%。而銅綠假單胞菌數(shù)量上升明顯，檢出率高達(dá)87.5%，成為優(yōu)勢菌種。

與膿毒癥未治療組比較，亞胺培南治療3 d組中，大腸桿菌和糞腸球菌檢出率降低，新檢出銅綠假單胞菌，陰溝桿菌和屎腸球菌，其中屎腸球菌檢出率為87.5%，肺炎克雷伯桿菌和變形桿菌檢出率進(jìn)一步升高。相比亞胺培南治療3 d組，7 d組中大腸桿菌、銅綠假單胞菌檢出率無變化，肺炎克雷伯桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、變形桿菌和屎腸球菌檢出率呈現(xiàn)輕微浮動(dòng)，而糞腸球菌檢出率明顯降低，同時(shí)陰溝桿菌檢出率降低為0。

表2 大鼠腸道細(xì)菌檢出情況Tab.2 rat intestinal bacteria detection

3 討論

腸道菌群失調(diào)及細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生多是由于廣譜抗生素濫用所致。本研究顯示，在大鼠膿毒癥模型上連續(xù)多日應(yīng)用頭孢曲松或亞胺培南均可導(dǎo)致腸道優(yōu)勢菌銳減，而部分條件致病菌成為優(yōu)勢菌群，提示頭孢曲松和亞胺培南作為2種臨床上常用的廣譜抗生素，長期大量使用可導(dǎo)致原籍菌群數(shù)量顯著減少，同時(shí)使得部分條件致病菌如銅綠假單胞菌和屎腸球菌等成為腸道優(yōu)勢菌群，繼而引發(fā)腸道微生態(tài)環(huán)境的紊亂。

宿主的原籍菌可阻止外來致病微生物的定植與侵襲［5-6］。腸道共生菌是腸道微生態(tài)環(huán)境的重要成分，可阻斷毒素、細(xì)菌等有害物質(zhì)的入侵，抑制并殺滅外襲致病菌［7-8］。然而目前，細(xì)菌耐藥性問題日益嚴(yán)重［9］。應(yīng)用頭孢曲松和亞胺培南易引起抗生素附加損害，經(jīng)常導(dǎo)致危重病患者腸道菌群紊亂。長期使用頭孢曲松和亞胺培南，可能選擇出耐藥菌和條件致病菌，并取代有益菌成為優(yōu)勢菌群［10］。本研究選用頭孢曲松和亞胺培南這2種常見廣譜抗生素處理經(jīng)過內(nèi)毒素注射的大鼠，模擬臨床上感染的膿毒癥病例，研究頭孢曲松和亞胺培南對腸道菌群的影響和變化規(guī)律，進(jìn)而分析細(xì)菌對頭孢曲松和亞胺培南的耐藥性。實(shí)驗(yàn)表明，膿毒癥未治療組菌落數(shù)（桿菌、球菌和真菌）較正常對照組都有增多的趨勢，而頭孢曲松治療3 d組中桿菌數(shù)較正常對照組和膿毒癥未治療組顯著降低，頭孢曲松治療7 d組相比膿毒癥未治療組下降顯著。相反，分析腸球菌和真菌數(shù)目時(shí)發(fā)現(xiàn)2種頭孢曲松治療時(shí)間均較對照組明顯上升。結(jié)合細(xì)菌檢出情況分析可知，原腸道優(yōu)勢菌大腸桿菌和糞腸球菌數(shù)目在頭孢曲松治療會(huì)銳減，而檢出其他新致病菌，其中銅綠假單胞菌成為優(yōu)勢菌群［11］。分析可知，頭孢曲松對大腸桿菌和糞腸球菌等腸道原籍菌具強(qiáng)烈殺滅作用，而新檢出的菌群銅綠假單胞菌和陰溝桿菌則呈現(xiàn)出頭孢曲松的不同程度耐藥性［12］。同時(shí)比較分析亞胺培南治療組與對照組細(xì)菌檢出情況，發(fā)現(xiàn)其嚴(yán)重抑制糞腸球菌的生長，屎腸球菌則對其產(chǎn)生100%耐藥性，其他菌群也對亞胺培南表現(xiàn)出不同程度抗性［13］?？梢?，頭孢曲松和亞胺培南2種抗生素表現(xiàn)出對腸道原籍菌的不同抑制作用，且抗生素的抑制作用隨處理時(shí)間的延長而增強(qiáng)，而新檢出的菌群數(shù)隨處理時(shí)間的延長而增多，部分菌群多產(chǎn)生相應(yīng)的耐藥性［14-15］。

綜上所述，頭孢曲松和亞胺培南易殺滅腸道敏感原籍菌，引起腸道微生態(tài)環(huán)境破壞，進(jìn)而造成腸源性感染，加劇了危重病病理生理過程。因而針對不同適應(yīng)癥科學(xué)合理的選用抗生素，并嚴(yán)格掌控抗生素的應(yīng)用時(shí)限，可一定程度上減少院內(nèi)感染的發(fā)生率。介于目前細(xì)菌耐藥性的問題，新型抗生素的篩選與改造及不同抗生素的交叉使用不失為防治細(xì)菌耐藥性的一種途徑，同時(shí)針對細(xì)菌耐藥性的分子機(jī)制研究也有望通過分子途徑，在基因水平上消除細(xì)菌的耐藥性。

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（編校：譚玲）

Influence of ceftriaxone and im ipenem to sepsis in the rat intestinal flora and bacterial drug resistance

BIAN Jin-jiong1，ZHOU Zu-mo1，ZHANG Su-jiang2

（1.Department of Infectious Diseases，Zhuji People’s Hospital，Zhuji311800，China；2.Department of infection，Jiangsu Province People’s Hospital，Nanjing 210029，China）

ObjectiveTo study the influence of ceftriaxone and imipenem to sepsis in the rat intestinal flora and bacterial drug resistance.Methods8 ratswere randomly included in normal control group from 48 healthy SD，and the rest of them were built the endotoxin sepsis model using 15mg／kg intraperitoneal injection of endotoxin.According towhether to apply antibiotics and application deadlines in 24 h aftermodeling，40 rats were randomly subdivided into sepsiswithout treatment group，sepsis ceftriaxone3 d group，sepsis ceftriaxone 7 d group，sepsis imipenem 3 d group and sepsis imipenem 7 d group（n＝8）.During ceftriaxone and imipenem injection treatment，in the corresponding time，colon contents were taken for enterobacteriaceae，enterococcus strains of quantitative culture and bacteria and fungi identification.ResultsAfter treatmentwith antibiotics，the number of rat intestinal bacteria decreased significantly（P＜0.05）.Ceftriaxone selected pseudomonas aeruginosa and enterobacter cloacae，while imipenem selected klebsiella pneumoniae，proteus and excrement enterococcus conditional pathogenic bacteria.All showed the inclination resistance.ConclusionCeftriaxone and imipenem antibiotics could decrease the original bacteria number，so pseudomonas aeruginosa and excrement enterococcus conditional pathogenic bacteria could become advantage bacterium group，causing intestinalmicro ecological environment disruption.

ceftriaxone；imipenem；rats；sepsis；drug resistance

R37

A

1005-1678（2014）03-0034-03

抗生素是由微生物或高等動(dòng)植物在生長中產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類次級代謝產(chǎn)物，是具有干擾其他生活細(xì)胞發(fā)育功能的一類化學(xué)物質(zhì)?？股夭粌H能殺滅細(xì)菌而且對霉菌、支原體、衣原體、螺旋體、立克次氏體等其它致病微生物也有較好的抑制和殺滅作用。抗生素的開發(fā)和應(yīng)用能夠明顯降低感染性疾病的死亡率，在治療嚴(yán)重的傳染病和危及生命的細(xì)菌感染中非常重要和必要。但臨床上濫用廣譜抗生素會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)微生物菌群的紊亂，大多數(shù)敏感菌和正常菌群被抑制或殺滅，但耐藥菌則獲得生存優(yōu)勢而大量繁殖致病，引發(fā)二重感染或重疊感染，并且抗生素的過度使用還可助長細(xì)菌的抗藥性。近年來，因抗生素濫用而引起多種細(xì)菌的耐藥性已成為全球備受關(guān)注的公共衛(wèi)生問題［1-2］。膿毒癥（sepsis）是指由感染引發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），臨床上常用三代頭孢菌素和碳青酶烯類頭孢曲松和亞胺培南對其進(jìn)行治療，但在治療過程中出現(xiàn)了體內(nèi)某些益生菌的嚴(yán)重受抑或死亡以及少數(shù)條件致病菌的耐藥性和易位［3-4］。本研究通過比較頭孢曲松和亞胺培南對膿毒癥大鼠腸道中3種主要菌群的影響，進(jìn)一步探討其對某些細(xì)菌的耐藥性，為臨床上對病重患者治療過程中抗生素的合理使用提供科學(xué)依據(jù)。

2011年度江蘇省衛(wèi)生廳面上科研課題（H201113）

邊金泂，男，本科，主治醫(yī)生，研究方向：感染內(nèi)科，E-mail：bianjinjiong＠sina.com。