大豆黃酮對(duì)人肝癌SMMC7721細(xì)胞增殖及腫瘤干細(xì)胞CD133表達(dá)的影響

張敏，孫宏治，王巍，白光，于曉東

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 肝膽外科，遼寧 錦州 121001；2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 普外科，遼寧 錦州 121001）

大豆黃酮對(duì)人肝癌SMMC7721細(xì)胞增殖及腫瘤干細(xì)胞CD133表達(dá)的影響

張敏1，孫宏治2Δ，王巍1，白光1，于曉東1

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 肝膽外科，遼寧 錦州 121001；2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 普外科，遼寧 錦州 121001）

目的探討大豆黃酮對(duì)人肝癌SMMC7721細(xì)胞增殖及腫瘤干細(xì)胞CD133表達(dá)的影響。方法將肝癌SMMC7721細(xì)胞分成6組：陰性對(duì)照組不加藥；根據(jù)添加大豆黃酮濃度的不同，分成 100μg／mL組、200μg／mL組、300μg／mL組、400μg／mL組、500μg／mL組，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后MTT法檢測(cè)細(xì)胞的抑制率、測(cè)定每組細(xì)胞中己糖激酶和堿性磷酸酶活性和CD133表達(dá)水平并進(jìn)行比較。結(jié)果大豆黃酮濃度越高，對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用越強(qiáng)；隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用有所下降；尤其在400μg／mL濃度組和500μg／mL濃度組，時(shí)間效應(yīng)更明顯。與對(duì)照組相比，經(jīng)不同濃度大豆黃酮處理的肝癌細(xì)胞己糖激酶活性和堿性磷酸酶活性均顯著降低（P＜0.01），腫瘤干細(xì)胞CD133表達(dá)明顯下降（P＜0.01），并且濃度越高下降幅度越大。結(jié)論大豆黃酮能夠抑制肝癌SMMC7721細(xì)胞的增殖，并降低腫瘤干細(xì)胞CD133的表達(dá)。

大豆黃酮；肝癌SMMC7721細(xì)胞；CD133

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 試驗(yàn)細(xì)胞為人肝癌細(xì)胞株SMMC7721細(xì)胞系（由中美合資博慧斯生物醫(yī)藥科技有限公司提供）。大豆黃酮為本實(shí)驗(yàn)室制備。MTT、胰蛋白酶由Sigma公司提供，CD133兔抗人單克隆抗體（上海領(lǐng)成生物科技有限公司），己糖激酶試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司），堿性磷酸酶試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）。培養(yǎng)器皿（北京冬璞泰和科技有限責(zé)任公司）。電泳儀（北京六一儀器廠，型號(hào)WD-9408C）。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)肝癌SMMC7721細(xì)胞37℃水浴解凍，然后將細(xì)胞制成混懸液離心，500 r／min，離心3min，保留沉淀。細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、消化、傳代，細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為10×104個(gè)／mL。將混懸液移入96孔板，進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 藥物處理 顯微鏡下可見細(xì)胞鋪滿孔板底時(shí)進(jìn)行分組加藥處理。根據(jù)加入大豆黃酮濃度的不同分為100μg／mL組、200μg／m L組、300μg／mL組、400μg／mL組、500μg／mL組，陰性對(duì)照組不處理。

1.3 觀察指標(biāo) 藥物分別作用24 h、48 h、72 h后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。采用MTT法測(cè)定細(xì)胞成活率，抑制率＝（陰性對(duì)照組OD值-加藥組OD值）／陰性對(duì)照組OD值×100%。按照己糖激酶試劑盒的操作說明測(cè)定己糖激酶活性，按照堿性磷酸酶試劑盒操作流程測(cè)定堿性磷酸酶活性。采用Western blot分析不同藥物濃度作用后肝癌細(xì)胞CD133蛋白表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，正態(tài)計(jì)量資料采用“x±s”表示，采用F檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用線性相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同大豆黃酮濃度、作用時(shí)間對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用

大豆黃酮濃度越高，對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用越強(qiáng)（P＜0.01），并且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用有所下降，尤其400μg／mL濃度組和500μg／mL濃度組，時(shí)間效應(yīng)更明顯（P＜0.01，見表1）。

表1 不同大豆黃酮濃度對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用Tab.1 Inhibition of Daidzein on hepatocellular carcinoma SMMC7721 cell

2.2 不同大豆黃酮濃度、作用時(shí)間對(duì)肝癌細(xì)胞己糖激酶活性的影響 經(jīng)不同大豆黃酮作用的肝癌細(xì)胞己糖激酶活性與對(duì)照組比較顯著下降（P＜0.01）。大豆黃酮濃度越高，己糖激酶活性越低，但是時(shí)間依賴性不明顯（見表2）。

表2 不同大豆黃酮濃度、作用時(shí)間對(duì)己糖激酶活性的影響Tab.2 Effect of Daidzein on Hexokinase activity

2.3 不同大豆黃酮濃度、作用時(shí)間對(duì)肝癌細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響 經(jīng)不同濃度大豆黃酮作用的肝癌細(xì)胞堿性磷酸酶活性與對(duì)照組比較均顯著下降（P＜0.01）。大豆黃酮濃度越高，堿性磷酸酶活性越低，但是時(shí)間依賴性不明顯（見表3）。

表3 不同大豆黃酮濃度、作用時(shí)間對(duì)堿性磷酸酶活性的影響Tab.3 Effect of Daidzein on alkaline phosphatase activity

2.4 不同大豆黃酮濃度作用肝癌細(xì)胞后對(duì)CD133表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，經(jīng)過不同大豆黃酮作用的肝癌細(xì)胞CD133表達(dá)均顯著下降（P＜0.01），并且濃度越高下降幅度越大（見表4，圖1）。

表4 不同大豆黃酮濃度作用肝癌細(xì)胞后對(duì)CD133表達(dá)的影響Tab.4 Effect of Daidzein on CD133 expression

圖1 不同大豆黃酮濃度處理后肝癌細(xì)胞CD133表達(dá)情況1.對(duì)照組；2.大豆黃酮100μg／mL組；3.大豆黃酮200μg／mL組；4.大豆黃酮300μg／mL組；5.大豆黃酮400μg／mL組；6.大豆黃酮500μg／mL組Fig.1 CD133 expression in hepatoma cells after different concentrations of daidzein1.control group；2.100μg／mL daidzein group；3.200μg／mL daidzein group；4.300μg／mL daidzein group；5.400μg／mLμg／mL daidzein group；6.500μg／mL daidzein group

3 討論

肝癌惡性程度高、進(jìn)展快、療效差、預(yù)后差、病死率高。目前肝癌的治療主要是手術(shù)治療、化療、放療、生物治療等，但總體上治療效果欠佳。肝癌早期可無任何征兆，而確診時(shí)往往已經(jīng)喪失了最佳的治療時(shí)機(jī)，不適合手術(shù)治療，只能采用保守治療［3-4］。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤中具有自我更新能力并能產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞［5-6］。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的特點(diǎn)與干細(xì)胞的基本特性十分相似，因此，腫瘤干細(xì)胞（tumor stem cell，TSC）理論的提出為我們重新認(rèn)識(shí)腫瘤的起源和本質(zhì)，以及臨床腫瘤治療等提供了新的方向和角度。腫瘤干細(xì)胞對(duì)腫瘤的存活、增殖、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)有著重要作用［7-9］。腫瘤干細(xì)胞可以長(zhǎng)時(shí)間處于休眠狀態(tài)并具有多種耐藥分子而對(duì)殺傷腫瘤細(xì)胞的外界理化因素不敏感，因此腫瘤往往在常規(guī)腫瘤治療方法消滅大部分普通腫瘤細(xì)胞后一段時(shí)間復(fù)發(fā)［10］。CD133是一種跨膜蛋白，是目前使用最多的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物，用于腫瘤干細(xì)胞的鑒別［11］。大豆黃酮是黃酮類化合物中的一種，主要存在于豆科植物中，其代謝生物學(xué)活性、蛋白質(zhì)合成、生長(zhǎng)因子活性，是天然的癌癥化學(xué)預(yù)防劑。具有預(yù)防乳腺癌、前列腺癌、心臟病、疏松癥、心血管疾病等作用，可用于防治乳腺、子宮內(nèi)膜、結(jié)腸、前列腺、肺、皮膚等癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和白血病等［12］。

葡萄糖是機(jī)體重要的能量來源，在葡萄糖的利用中，磷酸化是其分解的第一步，而己糖激酶是催化葡萄糖發(fā)生磷酸化的催化酶，此過程單向不可逆。因此己糖激酶的活性決定著糖類代謝的快慢，也影響到細(xì)胞對(duì)糖類的代謝使用［13］。在本次研究中，大豆黃酮能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞的己糖激酶活性，并且隨著濃度的升高，抑制作用越明顯。但是不同時(shí)間點(diǎn)，其抑制作用并沒有顯著差異，說明其對(duì)己糖激酶活性的抑制作用具有濃度依賴性，但沒有時(shí)間依賴性。

堿性磷酸酶屬于同源二聚體蛋白，分子量為56Kda，廣泛分布于人體各臟器器官中，其中以肝臟為最多。能催化核酸分子脫掉5’磷酸基團(tuán)，從而使DNA或RNA片段的5’-P末端轉(zhuǎn)換成5’-OH末端。與激酶的作用正相反，通過水解磷酸單酯將底物分子上的磷酸基團(tuán)除去，并生成磷酸根離子和自由的羥基，這類底物包括核酸、蛋白、生物堿等［14-15］。堿性磷酸酶和肝細(xì)胞的代謝狀況具有密切的相關(guān)性。因此通過檢測(cè)堿性磷酸酶的活性能夠間接反映肝癌細(xì)胞的活性。在本次研究中，大豆黃酮對(duì)肝癌細(xì)胞的堿性磷酸酶活性具有一定的抑制作用，并且隨著濃度的升高，其抑制作用也越來越強(qiáng)。但是其時(shí)間以來作用并不明顯。

通過分析不同濃度大豆黃酮作用過的肝癌細(xì)胞CD133的表達(dá)，分析大豆黃酮對(duì)腫瘤干細(xì)胞CD133表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，隨著濃度的升高，腫瘤干細(xì)胞CD133蛋白表達(dá)顯著下降，提示有可能大豆黃酮對(duì)腫瘤干細(xì)胞具有抑制作用，但是也不排除是腫瘤干細(xì)胞分化成了其他細(xì)胞，或者只是抑制了CD133的表達(dá)。對(duì)大豆黃酮作用過的肝癌細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示，不同濃度，其對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用不同，濃度越高，抑制作用越強(qiáng)，說明其對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用具有濃度依賴性。但是在400μg／mL和500μg／mL兩個(gè)濃度，24 h的抑制率顯著高于48 h和72 h的抑制率，具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究分析。

綜上所述，大豆黃酮能夠抑制人肝癌SMMC7721細(xì)胞的增殖，可能是通過抑制己糖激酶從而減少了腫瘤細(xì)胞對(duì)糖類能量的攝入。大豆黃酮作用后肝癌細(xì)胞雖然CD133表達(dá)下降，但其對(duì)腫瘤干細(xì)胞是否具有抑制作用，還需要選擇更可靠的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物做進(jìn)一步的研究。

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（編校：吳茜）

Effect of daidzein on hepatocellular carcinoma SMMC7721 cell proliferation and tumor stem cell CD133 expression

ZHANGMin1，SUN Hong-zhi2Δ，WANGWei1，BAIGuang1，YU Xiao-dong1

（1.Department of Hepatobiliary Surgery，The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College，Jinzhou 121001，China；2.Department of General Surgery，The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College Medical College，Jinzhou 121001，China）

ObjectiveTo discuss the effect of daidzein on hepatocellular carcinoma SMMC7721 cell proliferation CD133 expression on tumor stem cell.MethodsHepatocellular carcinoma SMMC7721 cellswere cultured，digested and passaged，and divided into six groupswith different drug：control group with no daidzein，100μg／mL daidzein group，200μg／mL daidzein group，300μg／mL daidzein group，400μg／mL daidzein group，500μg／mL daidzein.The inhibition ratio，hexokinase，alkaline phosphatase and CD133 levels in SMMC7721 cellwere detected and compared at24 h，48 h，72 h among those groups.ResultsThe inhibition ratiowas increased by Daidzein dose increasing，and decreased apparently by timesextending，especially in 400μg／mL and 500μg／mL daidzeingroups.Compared with control group，the hexokinase and alkaline phosphatase activity and CD133 expression were decreased apparently in groups treated with daidzein（P＜0.01）.Themore the dose，the higher the drop（P＜0.01）.ConclusionDaidzein can inhibit hepatocellular carcinoma SMMC7721 cell proliferation，and inhibit CD133 expression on tumor stem cell.

daidzein；hepatocellular carcinoma SMMC7721 cell；CD133

735.7

A

1005-1678（2014）03-0028-03

原發(fā)性肝癌多起病隱匿，發(fā)展迅速，患者預(yù)后差，死亡率占消化系統(tǒng)惡性腫瘤的第3位。CD133是腫瘤干細(xì)胞表面的腫瘤標(biāo)記物之一，腫瘤干細(xì)胞與細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥性等均具有密切的關(guān)系［1-2］。己糖激酶在糖代謝中發(fā)揮重要作用，其和堿性磷酸酶可反映細(xì)胞的代謝能力。研究顯示大豆黃酮能夠抑制肝細(xì)胞的增殖。本研究旨在探究大豆黃酮對(duì)肝癌細(xì)胞己糖激酶和堿性磷酸酶的影響，分析其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響和肝癌干細(xì)胞CD133表達(dá)的影響。

吳階平基金（320.6750.1393）

張敏，女，本 科，中級(jí)，研究方 向：肝膽外 科，E-mail：xiyuess011121＠sina.com；孫宏治，通信作者，男，博士，教授、主任醫(yī)師，研究方向：普外科，E-mail：cmushz＠163.com。