新疆厚葉巖白菜素提取方法優(yōu)化及不同部位含量的研究

吳紅紅，潘蘭，賈曉光，石明輝，庫(kù)麗夏西·馬尼，賈新岳

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊100193；2．中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所新疆分所新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002；3．新疆阿勒泰地區(qū)哈薩克醫(yī)醫(yī)院，新疆 阿勒泰830064）

新疆厚葉巖白菜素提取方法優(yōu)化及不同部位含量的研究

吳紅紅1，潘蘭2△，賈曉光2，石明輝2，庫(kù)麗夏西·馬尼3，賈新岳2

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊100193；2．中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所新疆分所新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002；3．新疆阿勒泰地區(qū)哈薩克醫(yī)醫(yī)院，新疆 阿勒泰830064）

目的對(duì)新疆厚葉巖白菜素進(jìn)行提取方法優(yōu)化及不同部位含量的測(cè)定，為高效提取厚葉巖白菜素提供依據(jù)。方法利用正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)醇提法的乙醇濃度、乙醇用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)4個(gè)因素進(jìn)行綜合考慮、篩選，以及對(duì)厚葉巖白菜素不同部位進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果優(yōu)選出最佳的乙醇提取新疆厚葉巖白菜素工藝條件為8倍量50%的乙醇，回流提取3次，每次0.5 h。厚葉巖白菜不同部位的巖白菜素差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。主根和須根中巖白菜素的含量較高，達(dá)到8.65%～9.58%，而葉中巖白菜素的含量相對(duì)較低，僅為0.15%。厚葉巖白菜素嫩葉含量顯著高于老葉。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)高效提取新疆厚葉巖白菜素提供了有力的技術(shù)支撐，同時(shí)為新疆厚葉巖白菜藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)奠定了理論基礎(chǔ)。

厚葉巖白菜素；醇提法；高效液相色譜

厚葉巖白菜[Bergenia crassifolia (L.) Fritsch]為虎耳草科、巖白菜屬多年生常綠草本[1-2]，是該屬中形體較大、花葉俱美、含藥物成分多、藥物成分含量高的種類，主要分布于新疆阿爾泰山1000～2600米的巖石縫隙及林下。該植物的根莖為哈薩克常用藥物，具止咳定喘，收斂止血之功效。用于腹瀉，痢疾，食欲不振，內(nèi)外出血，肺結(jié)核咳嗽，氣管炎，跌打損傷等癥[3-5]。

厚葉巖白菜在新疆地區(qū)應(yīng)用廣泛，但其提取方法較為繁瑣，提出率較低，研究還不深入[6-8]。因此，本研究通過(guò)對(duì)厚葉巖白菜的提取方法進(jìn)行優(yōu)化，明確不同部位含量，為厚葉巖白菜素的研究及藥理機(jī)制、新藥的研制奠定基礎(chǔ)，從而深入地挖掘這一民族藥資源，對(duì)新疆少數(shù)民族藥物的整理利用具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 材料 厚葉巖白菜由新疆阿勒泰地區(qū)哈薩克醫(yī)醫(yī)院提供，經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所賈曉光研究員鑒定為Bergenia crassifolia (L.) Fritsch，憑證標(biāo)本均存放于新疆中藥民族藥研究所標(biāo)本室。

多用粉碎機(jī)（9 FZ-25，四川簡(jiǎn)陽(yáng)市大地機(jī)械廠）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-S 2，金壇市醫(yī)療儀器廠）；電子天平（FA 1104 N,上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；三用紫外儀（ZF-2 C型，上海市安亭電子儀器廠）。Hypersil BDS色譜柱(5 μm；4.6 mm×200 mm),波長(zhǎng)275 nm，流動(dòng)相:甲醇∶水=25∶75，流速1.0 mL/min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 厚葉巖白菜素含量測(cè)定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取對(duì)照品厚葉巖白菜素3.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解，并定容至刻度，得到60 ug/mL。精確量取上述對(duì)照品溶液1.5 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。以甲醇為空白對(duì)照，在275 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。以縱坐標(biāo)作為濃度，橫坐標(biāo)為峰面積制定巖白菜素標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=10-7x-0.0053（r=0.96055），結(jié)果表明厚葉巖白菜素在0.41～2.05 μg呈良好線性關(guān)系。

1.2.2 供試樣品溶液的制備 取厚葉巖白菜粉末9份，每份5.0 g，分別按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)條件進(jìn)行提取，合并提取液，用蒸餾水定容到10 mL，轉(zhuǎn)移至大孔吸附樹(shù)脂柱中，靜止30 min后用300 mL去離子水洗脫至流出液無(wú)色，再用20%乙醇洗脫，取洗脫液0.1 mL置10 mL容量瓶中稀釋搖勻，并定容，于波長(zhǎng)275 nm處測(cè)定吸收度，計(jì)算出巖白菜素的含量。

1.2.3 正交設(shè)計(jì) 采用L 9(34)進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，以厚葉巖白菜素含量作為指標(biāo)，對(duì)乙醇濃度、乙醇用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)4 個(gè)因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化厚葉巖白菜素的提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 厚葉巖白菜醇提工藝的優(yōu)化 通過(guò)方差分析可以得知，提取次數(shù)對(duì)提取厚葉巖白菜素濃度的影響差異較顯著，乙醇濃度、用量及提取時(shí)間影響不顯著。結(jié)合直觀分析結(jié)果，試驗(yàn)編號(hào)6厚葉巖白菜素含量最高為13.79%，即以厚葉巖白菜素較佳提取工藝為：A2 B3 C1 D 3，即8倍量50%的乙醇，回流提取3次，每次 0.5 h（見(jiàn)表1、表2）。

表1 正交設(shè)計(jì)因素水平表Tab.1 Orthogonal design factors table

表2 厚葉巖白菜素正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Orthogonal test results of bergenia crassifolia pigment

2.2 厚葉巖白菜不同部位巖白菜素含量的比較

2.2.1 厚葉巖白菜老葉和嫩葉巖白菜素含量的比較 通過(guò)厚葉巖白菜老葉和嫩葉巖白菜素色譜圖比較分析，相同時(shí)間內(nèi)嫩葉巖白菜素峰面積顯著高于老葉巖白菜素峰面積，即厚葉巖白菜嫩葉巖白菜素含量顯著高于老葉（見(jiàn)圖1）。

圖1 栽培巖白菜老葉與嫩葉的比較色譜圖Fig.1 Comparison chromatograph chart of the old leaves and delicate leaf of Bergenia crassifolia

2.2.2 厚葉巖白菜不同部位巖白菜素含量比較 厚葉巖白菜不同部位中主根和須根巖白菜素的含量較高，達(dá)到8.65%～9.58%，而葉中巖白菜素的含量相對(duì)較低，僅為0.15%（見(jiàn)表3）。

表3 厚葉巖白菜不同部位巖白菜素含量比較(%)Tab.3 Content comparison of the different parts of Bergenia crassifolia(%)

3 討論

1997年龔建夫等用濃鹽酸調(diào)pH，70℃水浴加熱、抽濾等方法，得巖白菜素粗晶，粗晶于乙醇中，加活性炭、煮沸、過(guò)濾，放置，水洗烘干，即得巖白菜素成品[9]。1998年賈曉斌等采用正交試驗(yàn)法水提巖白菜素的復(fù)方制劑[10]，但該種方法步驟多，時(shí)間長(zhǎng)，提取率低，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出最佳的乙醇提取新疆厚葉巖白菜素工藝條件為8倍量50%的乙醇，回流提取3次，每次0.5 h。該方法具有操作簡(jiǎn)單、使用方便、價(jià)格便宜、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，能夠有效的進(jìn)行新疆厚葉巖白菜素的提取。通過(guò)優(yōu)化工藝厚葉巖白菜素的提取率由原來(lái)的4.38%[11-12]提高至11.6%。該方法值得進(jìn)一步開(kāi)展研究，探索實(shí)現(xiàn)厚葉巖白菜素提取的產(chǎn)業(yè)化。

厚葉巖白菜中的不同部位巖白菜素存在明顯差異[13-14]。主根和須根中巖白菜素的含量較高，達(dá)到8.65～9.58%，而葉中巖白菜素的含量相對(duì)較低，僅為0.15%。厚葉巖白菜素嫩葉含量明顯高于老葉。厚葉巖白菜雖在新疆廣泛應(yīng)用，但并未載入《中國(guó)藥典》，哈薩克族長(zhǎng)期應(yīng)使用的結(jié)果證明，該藥療效顯著，是值得開(kāi)發(fā)的品種，但該藥的野生資源僅分布于我國(guó)的新疆阿勒泰地區(qū)，由于近年來(lái)需求量加大，該資源逐漸貧乏。該藥野生資源少，且以根入藥資源破壞大，能否以其余部位如葉或地上部分入藥是該藥今后值得研究的方向[15]。本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)新疆厚葉巖白菜藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)奠定了理論基礎(chǔ)。

[1] 潘錦堂.中國(guó)植物志[M].北京:科學(xué)出版社,1992:35.

[2] 呂修梅 ,王軍憲 .巖白菜屬植物的研究進(jìn)展 [J].中藥材,2003,26(1):58-60.

[3] 肖珍環(huán).湖北習(xí)用巖白菜的生藥鑒別．武漢職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1995，23（4）：29-30.

[4] 徐新,巴哈爾古麗·黃爾汗.哈薩克藥志(第一卷)[M].北京:民族出版社,2009:164.

[5] 周琴,賈新岳,潘蘭,等.哈薩克民間藥用角果藜化學(xué)成分初步研究[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,49(5):891-894.

[6] 任靜，李多偉，陳俐宏，等.反相高效液相色譜法測(cè)定鬼燈檠中巖白菜素的含量[J].理化檢驗(yàn).（化學(xué)分冊(cè)），2005，(05)：329-330.

[7] 丁家欣，張秋海，張玲，等.HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地與采收期虎耳草中巖白菜素的含量[J].中國(guó)中藥雜志，2002，27(10)：792-793.

[8] 彭永芳，熊杰.巖白菜素提取工藝的改進(jìn)[J].昆明師專學(xué)報(bào)，1996，11(1)：46-49．

[9] 龔健夫.從落新婦中提取巖白菜素的新工藝[J].湖南中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，1997,13（2/3）：83-84.

[10] 賈曉斌.正交試驗(yàn)法優(yōu)選清金糖漿水提取工藝[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,1998,9(1):12.

[11] 云南大理州制藥廠.巖白菜中巖白菜素的分離與藥理試驗(yàn)[J].中草藥通訊,1975，(6):12-13.

[12] 胡文杰.朱砂根巖白菜素純化條件優(yōu)化[J].林業(yè)科技開(kāi)發(fā)，2008，22(4)：76-78．

[13] 方曉玲.巖白菜素硬膠囊劑的處方工藝與溶出度研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，1992，27(2)：105-108．

[14] 呂麗芬,袁理春,楊麗云等.巖白菜和巖陀中巖白菜素含量的比較[J].中藥材,2008,31(4):488-489.

[15] 潘蘭,李曉瑾,賈曉光,等.癅果黑種草化學(xué)成分的初步研究[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,47(2):300-302.

Studies on the optimization of extraction method and content of different parts in XinJiang Bergenia crassifolia (L.)

WU Hong-hong1, PAN Lan2△, JIA Xiao-guang2, SHI Ming-hui2, Kulixiaxi Mani3, JIA Xin-yue2
(1. Hospital of traditional Chinese medicine of xinjiang medical university autonomous region, Urumqi 830002, China; 2. Xinjiang Institute of Chinese Materia Madica and Ethnodrug, Urumqi 830002, China; 3. Xinjiang Altay Prefecture Kazakh Medical Hospital, Altay 830064, China)

ObjectiveTo extraction method optimization and the content of the different parts of Xinjiang Bergenia crassifolia (L.), provide the basis for ef fi cient extraction of Bergenia crassifolia pigment。MethodUsing the orthogonal experiment, the alcohol extraction process of ethanol concentration, dosage of ethanol, extraction time, extraction times, as well as to Bergenia crassifolia pigment content of the different part。ResultsOf optimization, the best ethanol extract of xinjiang Bergenia crassifolia pigment process conditions is 8 times the amount of 50% ethanol, extracting 3 times, each time 0.5 h. In Bergenia crassifolia pigment content of different parts exists obvious difference. Bergenia crassifolia pigment content of Taproot and fi brous root is higher, at 8.65% to 9.58%, while Bergenia crassifolia pigment content of the leaves is relatively low, at just 0.15%. Bergenia crassifolia pigment content of leaves signi fi cantly higher than the old leaves。ConclusionThis experimental study on ef fi cient extraction of xinjiang Bergenia crassifolia pigment to provide strong technical support and theoretical basis.

bergenia crassifolia pigment; alcohol extraction process; high performance liquid chromatography

R 914.1

A

1005-1678(2014)01-0074-02

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金（2013211A112）

吳紅紅，女，副主任醫(yī)師，研究方向：慢阻肺的治療研究，E-mail: smwhh@163.com；潘蘭，通信作者，女，助理研究員，E-mail: panlan_sc@126.com。