慢性牙周炎患者齦下菌斑和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中福賽坦氏菌的檢測(cè)及同源性分析

陳 凌， 吳 贇， 汪義永， 魏 斌

近年來多項(xiàng)研究表明，感染因素在動(dòng)脈粥樣硬化及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[1-2]。牙周炎是發(fā)生在牙齒周圍組織的感染性疾病，是多種全身性疾病如冠心病、糖尿病、低體質(zhì)量早產(chǎn)兒等的危險(xiǎn)因素[3]。福賽坦氏菌(Tannerellaforsythensis，Tf)與牙周炎發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。研究顯示，Tf既可定植于牙周炎病變部位，也可在牙周健康部位檢出，在牙周炎患者或牙周炎癥部位檢出率較高[4]。

本研究采用PCR擴(kuò)增細(xì)菌DNA片段的方法檢測(cè)慢性牙周炎患者的齦下菌斑、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中Tf，通過比對(duì)2個(gè)樣本中Tf的同源性，研究Tf和動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 2010年11月-2011年12月，在住院患者中選擇伴有慢性牙周炎并且需要行動(dòng)脈外科手術(shù)病例21例，其中男性13例，女性8例，年齡中位數(shù)74.5歲(62～93歲)；其中牙周病輕度3例，中度8例，重度10例。慢性牙周炎納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)成年人，男女不限，年齡不限；(2)有明顯的菌斑、牙石及局部刺激因素，且與牙周組織的炎癥和破壞程度比較一致；(3)病情進(jìn)展緩慢，也可間有快速進(jìn)展的活動(dòng)期；(4)全身一般健康，也可有某些危險(xiǎn)因素，如吸煙、精神壓力、骨質(zhì)疏松等；(5)已排除侵襲性牙周炎；(6)根據(jù)累及的牙位數(shù)，可進(jìn)一步分為局限型(<30%位點(diǎn))和廣泛型(>30%)；(7)根據(jù)牙周附著喪失(AL)的程度，可分為：輕度(AL 1～2 mm)、中度(AL 3～4 mm)和重度(AL≥5 mm)。排除標(biāo)準(zhǔn)：剔除患有其他全身系統(tǒng)性疾病、藥物過敏史、3月內(nèi)有抗生素、腎上腺皮質(zhì)激素、非甾體類抗炎藥、性激素及避孕藥等應(yīng)用史者，心梗發(fā)生以及牙周治療均須間隔6月以上。本研究通過福建醫(yī)科大學(xué)生物研究倫理審查委員會(huì)審查，所有研究對(duì)象均知情同意并簽字。

1.2方法

1.2.1主要試劑和設(shè)備 PCR反應(yīng)體系、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、溶菌酶(北京天根生化科技有限公司)，基因組DNA純化試劑盒(Promega公司)，蛋白酶K(美國Sigma公司)，Tf國際參考標(biāo)準(zhǔn)菌株(四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供)。Tf引物[5](上海生工生物工程有限公司合成)預(yù)期擴(kuò)增片段長度為222 bp，退火57 ℃、30 s。ABI 9700 PCR擴(kuò)增儀(美國ABI公司)，微量核酸-蛋白定量儀(德國Eppendorf公司)。

Tf引物：

上游：GTCGGACTAATACCTCATAAAACA

下游：TCGCCCATTGACCAATATT

1.2.2標(biāo)本的收集和處理 手術(shù)前一天所有患者進(jìn)行全口天然牙的牙周袋探診深度(PD)、附著喪失(AL)、菌斑指數(shù)(PLI)、出血指數(shù)(SBI)、牙石指數(shù)(CI)檢查，由同一名醫(yī)生完成。齦下菌斑樣本的收集：選取患者口內(nèi)PD≥4 mm的4個(gè)不同位點(diǎn)的患牙，患牙牙周袋最深的部位作為采樣的位點(diǎn)，無菌齦上刮治器去除取樣牙的齦上菌斑，棉卷隔濕干燥，用另一無菌齦下刮治器刮取齦下菌斑，放入同一盛有生理鹽水的無菌Ep管中，-80 ℃保存。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊樣本的收集：由外科醫(yī)生在手術(shù)中收集，并立刻置于盛有生理鹽水的無菌Ep管中，-80 ℃保存。

1.2.3細(xì)菌DNA的提取 按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明操作提取標(biāo)準(zhǔn)菌株、齦下菌斑及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊標(biāo)本中的DNA序列。

1.2.4PCR反應(yīng)體系及條件 PCR反應(yīng)體系：DNA模板3 μL，2×Hot Start Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上游引物(25 μmol/L)0.3 μL，下游引物(25 μmol/L)0.3 μL，H2O 8.9 μL，總體積25 μL。PCR反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[5]。

1.2.5PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳、測(cè)序 取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8 μL，2%瓊脂糖凝膠電泳，用紫外線檢測(cè)儀觀察擴(kuò)增條帶，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中檢測(cè)到的牙周致病菌送往英杰生命技術(shù)公司檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1牙周臨床指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 PD(5.62±0.63)mm(3.84～6.47 mm)，AL(4.26±2.21)mm(1.46～6.72 mm)，SBI(2.84±0.67)(1.94～3.72)，PLI(2.24±0.37)(1.57～2.86)，CI(2.04±0.73)(1.25～2.83)。

2.2Tf的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳Tf特異引物擴(kuò)增后出現(xiàn)目的條帶，分子量大小與參考菌株基本相同，片段大小為200～300 bp，與預(yù)期的222 bp相符(圖1)。

1：Tf標(biāo)準(zhǔn)菌株；2：齦下菌斑Tf陽性樣本；3：動(dòng)脈粥樣硬化斑塊Tf陽性樣本；4：Takara 100 bp DNA markers(dye plus)；5：空白對(duì)照組.

2.3Tf檢出率 21例中，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中Tf陽性6例，檢出率29%；齦下菌斑中Tf陽性15例，檢出率71%；在同一患者齦下菌斑及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中Tf檢測(cè)均陽性5例，檢出率24%。

2.4測(cè)序 將動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中檢測(cè)到的TfPCR產(chǎn)物測(cè)序，并將基因序列與GenBank中標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，表明是Tf(圖2，3)。

2.5同源性檢測(cè) 將同一患者2個(gè)樣本Tf均為陽性的的標(biāo)本PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果通過blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其符合Genbank中的標(biāo)準(zhǔn)序列，這兩種不同來源的Tf間具有高度的同源性，基因序列相似度99%(圖4)。

圖2 動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中Tf PCR產(chǎn)物的部分基因測(cè)序結(jié)果

3 討 論

牙周炎癥感染的情況下，牙周支持組織受到不同程度的破壞，牙周袋內(nèi)的上皮組織可產(chǎn)生潰瘍，使牙周袋內(nèi)的病原菌可能進(jìn)入血液，導(dǎo)致短暫、低水平的菌血癥發(fā)生。Tf與牙周炎發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，重度牙周病患者的齦下菌斑中經(jīng)?？蓹z出Tf。Tf為革蘭陰性厭氧菌，其細(xì)胞壁中的脂多糖可引發(fā)宿主免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-1、6、8及腫瘤壞死因子-α等多種細(xì)胞因子產(chǎn)生，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。研究發(fā)現(xiàn)，牙周炎患者檢出Tf比率為56.5%，與牙周健康人群對(duì)比顯著增高；并且牙周破壞程度加劇，牙周袋內(nèi)檢測(cè)出Tf的比率也升高[7]。

圖3 動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中檢測(cè)到的Tf PCR測(cè)序結(jié)果與GenBank參考序列比對(duì)

圖4 齦下菌斑及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中Tf 同源性比對(duì)

在病損的血管和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊里均檢測(cè)出口腔細(xì)菌感染物是支持慢性口腔感染與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)聯(lián)的有力證明。Chiu等收集了進(jìn)行冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)的患者，發(fā)現(xiàn)術(shù)中取得的粥樣硬化斑塊中存在2種牙周來源的致病菌(牙齦卟啉單胞菌和血鏈球菌)[8]。Jain等發(fā)現(xiàn)，發(fā)生牙周炎的兔動(dòng)脈粥樣硬化模型與無牙周炎模型相比，有更多類脂沉積于動(dòng)脈壁，且隨著牙周炎的加重類脂的沉積程度越嚴(yán)重[9]。Figuero等研究了70例外周動(dòng)脈疾病或腹主動(dòng)脈瘤患者，發(fā)現(xiàn)其血管及血液樣本中常見牙周致病菌(伴放線聚集桿菌、牙齦卟啉單胞菌、直腸彎曲菌、Tf)檢出率分別為7.1%和11.4%[10]。Mahendra等收集了51例接受冠狀動(dòng)脈搭橋的慢性牙周炎患者的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊標(biāo)本，結(jié)果表明伴放線聚集桿菌、Tf、牙齦卟啉單胞菌、牙齦卟啉單胞菌黏附因子菌毛蛋白A基因、齒垢密螺旋體檢出率分別為0，31.4%，45.1%，39.2%和51%[11]。楊泓等檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的3種牙周致病菌，發(fā)現(xiàn)重度牙周炎組Tf檢出率(25%)比輕度牙周炎組(7.69%)明顯增高[12]。安娜等研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣斑塊樣本中可檢出3種可疑牙周致病菌，其中牙齦卟啉單胞菌陽性率為30%，Tf陽性率為10%[13]。由此可見，多數(shù)研究都從動(dòng)脈粥樣硬化斑塊檢測(cè)出牙周致病菌，從而確定牙周感染與動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)性。但是要確定分別從動(dòng)脈粥樣硬化斑塊與牙周組織來源的致病菌之間的相似度究竟如何，需要同時(shí)檢測(cè)同一患者動(dòng)脈粥樣硬化斑塊及齦下菌斑同種牙周致病菌并進(jìn)行分析，比對(duì)兩種來源致病菌的相關(guān)性，此類相關(guān)研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，Tf在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、齦下菌斑中的檢出率為29%和71%，檢出Tf的DNA符合Genbank中的標(biāo)準(zhǔn)序列，在同一患者齦下菌斑及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中檢出率為24%，且2種不同來源的Tf間具有高度的同源性，其基因序列相似度為99%。本課題組前期已經(jīng)在慢性牙周炎患者的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中找到了2種牙周致病菌(伴放線聚集桿菌、牙齦卟啉單胞菌)DNA[14]，與前期研究相比，Tf無論是在檢出率還是核酸的相似程度方面都更高，因此推測(cè)牙周感染中存在的Tf可能對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展起到更為重要的作用，但仍需要大樣本的研究證實(shí)。

本研究結(jié)果提醒臨床醫(yī)生應(yīng)重視牙周疾病與心血管病的關(guān)系，在進(jìn)行牙周衛(wèi)生指導(dǎo)時(shí)，提醒患者積極去除牙周組織可能存在的危險(xiǎn)因素，降低動(dòng)脈粥樣硬化及其他血栓栓塞性疾病發(fā)生的危險(xiǎn)。

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