抵抗素在伴高脂血癥性急性壞死性胰腺炎大鼠發(fā)病中的作用

吳 婷， 林珊珊

肥胖及高血脂與急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)關(guān)系密切，不僅誘發(fā)AP，而且加重胰腺組織的病理損害，但是其加重?fù)p害的機(jī)制至今未完全闡明。研究已表明，AP時(shí)抵抗素合成分泌增加[1]，抵抗素具有促進(jìn)炎癥介質(zhì)產(chǎn)生及微循環(huán)障礙的作用，從而加重AP的病情。伴高脂血癥性AP(hyperlipidemic acute pancreatitis, HAP)時(shí)抵抗素水平的變化國內(nèi)外研究較少，本研究擬通過飲食方式誘導(dǎo)建立高脂血癥大鼠模型，研究伴與不伴高脂血癥的急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis, ANP)大鼠血清及胰腺組織抵抗素表達(dá)的變化，以及其與炎癥細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)之間的關(guān)系，以期進(jìn)一步了解抵抗素在伴高脂血癥的ANP發(fā)病機(jī)制中的可能作用。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物模型建立與分組 健康雄性SD大鼠[上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SOXK(閩)2012-0001]50只，體質(zhì)量170～180 g。隨機(jī)分為正常對(duì)照組(C組)5只、單純ANP組(ANP組)15只、高脂對(duì)照組(H組)15只、高脂ANP組(HAP組)15只。分別用基礎(chǔ)飼料(C、ANP組)及高脂飼料(H、HAP組)喂養(yǎng)4周；高脂飼料配方[2](主要成分為87.8%基礎(chǔ)飼料+10%豬油+2%膽固醇+0.2%膽酸鈉等，購自閩侯縣吳氏動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)。ANP及HAP組采用傳統(tǒng)的手術(shù)方法制備ANP模型(3.5%牛磺膽酸鈉1 mL/kg體質(zhì)量，以0.2 mL/min的速度逆行胰膽管注射)；C、H組采用逆行胰膽管注射生理鹽水，劑量和速度同上。造模成功后4，9，24 h各處死5只大鼠，抽血測(cè)定血清淀粉酶、膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平，取胰頭組織行H-E染色，胰腺組織病理半定量積分參照Kusske法[3](對(duì)胰腺組織在光鏡下的表現(xiàn)按水腫、炎癥細(xì)胞浸潤、壞死3方面的輕重程度評(píng)分，共分3級(jí)，無病理改變者0分，最重者9分)。

1.2血清TNF-ɑ和抵抗素水平的測(cè)定 腹腔動(dòng)脈采血5～6 mL，靜置1 h后3 000 r/min離心10 min分離血清，置于-20 ℃冰箱，待標(biāo)本收集后吸取各組實(shí)驗(yàn)大鼠血清上清液50 μL，采用ELISA法測(cè)定血清TNF-ɑ和抵抗素濃度，嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。

1.3胰腺組織抵抗素及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65表達(dá)水平的測(cè)定

1.3.1石蠟切片制備 分別于造模后4，9，24 h各處死5只大鼠，剖腹后取胰腺組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，切片5 μm并附于經(jīng)多聚賴氨酸附膜的載玻片上，保存于4 ℃冰箱中。

1.3.2超敏二步免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胰腺組織抵抗素及NF-κB p65表達(dá)水平 石蠟切片置于37 ℃恒溫箱中烤片過夜，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉等處理后，滴加一抗(1∶100兔抗大鼠NF-κB p65抗體及1∶25羊抗大鼠抵抗素抗體，購自Santa Cruz公司)后置于濕盒中，37 ℃恒溫箱中孵育2 h，滴加試劑1(Polymer Helper)室溫孵育20 min，滴加試劑2(poly-HRP anti-Rabbit IgG)室溫孵育20 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗，脫水透明，封片鏡檢。陽性對(duì)照由購買相應(yīng)抗體的試劑公司提供，PBS替代一抗作陰性對(duì)照。

1.3.3使用專業(yè)圖像分析軟件Image-Pro Plus計(jì)算各組胰腺組織抵抗素及NF-κB p65表達(dá)的平均光密度值。

2 結(jié) 果

2.1模型鑒定 全部大鼠飼養(yǎng)4周后手術(shù)，直至模型制備完畢后24 h，各組大鼠無一死亡，其中C、H組大鼠狀態(tài)較好，大多數(shù)可活動(dòng)或飲水，ANP、HAP組大鼠大多精神萎靡、懶動(dòng)，基本無活動(dòng)或飲水。造模成功率100%。

ANP組血清淀粉酶水平較C、H組明顯升高，高脂飼料組血清TC、TG水平高于正常飼料組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。光鏡下觀察，ANP、HAP組胰腺組織明顯水腫，尤其是HAP組，造模后9，24 h在壞死、出血、炎性細(xì)胞浸潤程度、胰腺組織病理學(xué)評(píng)分等方面較ANP組顯著加重，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 各組血清淀粉酶、血脂水平及胰腺組織病理學(xué)評(píng)分

2.2大鼠血清TNF-ɑ水平測(cè)定結(jié)果 與C組比較，ANP組和HAP組大鼠術(shù)后4 h血清TNF-ɑ水平已明顯升高，24 h時(shí)達(dá)到高峰，各時(shí)間點(diǎn)血清TNF-ɑ濃度明顯高于對(duì)照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與ANP組比較，HAP組大鼠術(shù)后4和9 h TNF-ɑ水平無明顯變化(P>0.05)，但24 h明顯升高(P<0.05)，具體見表2。

表2 血清TNF-ɑ水平

2.3大鼠血清抵抗素水平測(cè)定結(jié)果 與C組比較，ANP組大鼠術(shù)后4 h血清抵抗素水平開始升高，24 h時(shí)達(dá)到高峰，明顯高于對(duì)照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與H組比較，HAP組大鼠術(shù)后4 h血清抵抗素濃度開始升高，24 h時(shí)濃度明顯高于H組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與ANP組比較，HAP組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)抵抗素水平均明顯高于ANP組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

表3 血清抵抗素水平

2.4血清抵抗素水平與TNF-ɑ水平、胰腺組織病理學(xué)評(píng)分相關(guān)分析 血清TNF-ɑ和抵抗素水平均在造模后迅速上升，至24 h達(dá)高峰，HAP組和ANP組的血清抵抗素水平和TNF-ɑ水平均呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.365和r=0.698，P<0.05)，ANP組胰腺組織病理學(xué)評(píng)分與血清抵抗素、TNF-ɑ水平均呈正相關(guān)(r=0.657和r=0.732，P<0.05)，HAP組胰腺組織病理學(xué)評(píng)分與血清抵抗素、TNF-ɑ水平均呈正相關(guān)(r=0.632和r=0.661，P<0.05)。

2.5大鼠胰腺組織NF-κB p65表達(dá)水平 造模后早期胰腺組織NF-κB p65表達(dá)水平即升高，與C組和H組比較，ANP組和HAP組4 h胰腺組織NF-κB p65表達(dá)增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，主要表達(dá)于胰腺腺泡細(xì)胞和間質(zhì)炎癥細(xì)胞，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，NF-κB p65表達(dá)逐漸增加，24 h達(dá)高峰(圖1)。HAP組各時(shí)間點(diǎn)胰腺組織NF-κB p65表達(dá)水平均較ANP組增高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，具體見表4。

表4 胰腺組織NF-κB p65平均光密度值

A：C組，B：H4h組，C：H9h組，D：H24h組，E：ANP4h組，F(xiàn)：ANP9h組，G：ANP24h組，H：HAP4h組，I：HAP9h組，J：HAP24h組. C組及H組各時(shí)間點(diǎn)胰腺組織均未見明顯NF-κB p65表達(dá)，ANP組及HAP組各時(shí)間點(diǎn)均可見NF-κB p65表達(dá)，主要表達(dá)于腺細(xì)胞胞質(zhì)及小葉間質(zhì)中. NF-κB p65表達(dá)呈時(shí)間依賴性，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)逐漸增加；與ANP組比較，HAP組各時(shí)間點(diǎn)有更明顯的NF-κB p65表達(dá).

2.6大鼠胰腺組織抵抗素表達(dá)水平 與C組比較，H24h組胰腺組織抵抗素表達(dá)水平有所增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與C組和H組比較，ANP4h和HAP4h胰腺組織抵抗素表達(dá)增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2，表5。

2.7胰腺組織抵抗素表達(dá)水平與胰腺組織NF-κBp65表達(dá)水平、胰腺組織病理學(xué)評(píng)分相關(guān)分析 胰腺組織抵抗素和NF-κB p65表達(dá)水平在造模后迅速上升，至24 h達(dá)高峰，HAP組和ANP組的胰腺組織抵抗素表達(dá)水平和NF-κB p65表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.839和r=0.957，P<0.01)，ANP組胰腺組織病理學(xué)評(píng)分與胰腺組織抵抗素及NF-κB p65表達(dá)水平均呈正相關(guān)(r=0.946和r=0.944，P<0.01)，HAP組胰腺組織病理學(xué)評(píng)分與胰腺組織抵抗素及NF-κB p65表達(dá)水平均呈正相關(guān)(r=0.904和r=0.857，P<0.01)。

A：C組，B：H4h組，C：H9h組，D：H24h組，E：ANP4h組，F(xiàn)：ANP9h組，G：ANP24h組，H：HAP4h組，I：HAP9h組，J：HAP24h組. C組及H組各時(shí)間點(diǎn)胰腺組織均未見明顯抵抗素表達(dá)，ANP組及HAP組各時(shí)間點(diǎn)均可見抵抗素的表達(dá)，主要表達(dá)于胰腺腺泡細(xì)胞和胰腺壞死區(qū)域中；抵抗素表達(dá)呈時(shí)間依賴性，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)逐漸增加.

表5 胰腺組織抵抗素平均光密度值

3 討 論

SAP是全身炎癥反應(yīng)性疾病，其病理過程是胰腺腺泡內(nèi)胰酶的異常激活，活化的胰酶對(duì)胰腺組織自身進(jìn)行消化，導(dǎo)致單核巨噬細(xì)胞的激活、炎癥介質(zhì)的釋放，最后通過炎癥介質(zhì)的相互作用促進(jìn)炎癥的擴(kuò)大[4]。細(xì)胞因子屬于炎癥介質(zhì)的范疇，目前認(rèn)為與AP關(guān)系較為密切的細(xì)胞因子有TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8等，這些炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)在基因水平上受到轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的調(diào)控。NF-κB信號(hào)通路參與了AP的發(fā)病及病情發(fā)展，多項(xiàng)研究均發(fā)現(xiàn),AP早期即有NF-κB的活化，胰腺組織NF-κB表達(dá)增加，藥理學(xué)抑制NF-κB能夠改善胰腺炎的病情,通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)胰腺p65和IKK2表達(dá)能夠引起胰腺炎[5-8]。Huang等通過轉(zhuǎn)基因途徑構(gòu)建胰腺組織編碼p65的小鼠動(dòng)物模型，通過與正常小鼠的比較發(fā)現(xiàn)：p65轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)哇皮素誘導(dǎo)胰腺炎模型后有更高的炎癥因子水平，胰腺組織病理損害更重。持續(xù)3月的胰腺組織NF-κB活化導(dǎo)致了胰腺組織類似慢性胰腺炎的病理改變[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，AP造模后4 h胰腺組織NF-κB p65表達(dá)水平即升高，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，NF-κB p65表達(dá)逐漸增加，24 h達(dá)高峰，胰腺組織病理學(xué)評(píng)分與胰腺組織NF-κB p65表達(dá)水平均呈正相關(guān)。與ANP組比較，HAP組胰腺組織病理損害更重，同時(shí)胰腺組織NF-κB p65表達(dá)水平更高。

脂肪細(xì)胞因子抵抗素作為上游炎癥介質(zhì)，具有調(diào)節(jié)新陳代謝和免疫反應(yīng)的作用，它不僅能夠募集炎癥細(xì)胞，刺激TNF-α、IL-2、IL-6等促炎細(xì)胞因子的釋放，還可以促進(jìn)微循環(huán)障礙的形成[10-11]，從而加重AP的病情。AP患者及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中都觀察到升高的抵抗素水平，抵抗素升高的水平與病情的嚴(yán)重程度及血清CRP水平呈正相關(guān)，能夠作為胰周脂肪壞死的標(biāo)志，可以預(yù)測(cè)胰周脂肪壞死的范圍及病情的嚴(yán)重程度[1]，這些均提示AP時(shí)胰周脂肪組織壞死釋放的抵抗素可能通過促炎癥作用而加重病情。目前關(guān)于抵抗素與AP的研究多為臨床研究，國內(nèi)徐克群等通過L-精氨酸腹腔內(nèi)注射誘導(dǎo)大鼠ANP模型，發(fā)現(xiàn)ANP模型大鼠血清和胰腺組織的抵抗素表達(dá)水平明顯升高，與血清TNF-α、IL-1β、CRP水平和胰腺組織病理評(píng)分呈正相關(guān)，注射重組抵抗素后，血清TNF-α、IL-1β水平升高[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與C組相比，ANP組和HAP組造模術(shù)后4 h血清及胰腺組織抵抗素表達(dá)開始升高，24 h達(dá)高峰，血清抵抗素水平與TNF-α水平呈正相關(guān)，胰腺組織抵抗素表達(dá)與NF-κB p65表達(dá)、胰腺組織病理學(xué)評(píng)分呈正相關(guān)，也支持抵抗素可能通過NF-κB信號(hào)途徑促進(jìn)TNF-α的釋放參與ANP病情的發(fā)生發(fā)展。

隨著膳食結(jié)構(gòu)的改變，高脂血癥及肥胖人群增加，高脂血癥肥胖與胰腺炎之間的因果關(guān)系存在爭(zhēng)議。本課題組前期研究證實(shí)了高脂血癥不僅誘發(fā)AP，而且能加重AP時(shí)胰腺組織的病理損害[13-14]。楊體雄等的研究發(fā)現(xiàn)，在相同致病因素前提下，高TG血癥是導(dǎo)致胰腺炎進(jìn)一步發(fā)展的促進(jìn)因素[15]。同時(shí)臨床研究發(fā)現(xiàn)，肥胖是胰腺炎發(fā)生發(fā)展的一個(gè)危險(xiǎn)因素，與非肥胖患者相比，肥胖患者胰腺炎的發(fā)生率更高，尤其腹型肥胖與AP病情的嚴(yán)重性相關(guān)[16-18]，這些觀察提示腹腔內(nèi)脂肪組織可能在AP發(fā)病中起重要的病理生理作用。國內(nèi)外一些研究[1,12]及本研究均證實(shí)，AP時(shí)胰腺組織及胰周脂肪細(xì)胞壞死可能引起抵抗素的釋放，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，而高脂肥胖雙重致病因素作用下的胰腺炎抵抗素的表達(dá)怎樣尚未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過高脂喂養(yǎng)4周,經(jīng)淀粉酶、血脂、病理評(píng)分等評(píng)估，說明高脂飼料喂養(yǎng)4周能夠成功建立伴高脂血癥性ANP大鼠模型，高脂血癥能加重急性胰腺炎時(shí)胰腺組織的病理損害。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與C組和H組比較，ANP和HAP組各時(shí)間點(diǎn)血清及胰腺組織抵抗素表達(dá)水平均明顯升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明抵抗素參與了重癥AP的發(fā)病。與ANP組各時(shí)間點(diǎn)比較，HAP組血清及胰腺組織抵抗素表達(dá)水平更高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而且與TNF-α、與NF-κB p65表達(dá)、胰腺組織病理學(xué)評(píng)分呈正相關(guān)，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在相同致病因素前提下，高脂肥胖可能通過增加血清及胰腺組織抵抗素的表達(dá)激發(fā)炎癥細(xì)胞因子的釋放從而導(dǎo)致胰腺組織病理損害較重。當(dāng)然，脂肪細(xì)胞因子除抵抗素外還有脂聯(lián)素、內(nèi)脂素等，關(guān)于其他脂肪細(xì)胞因子在AP發(fā)病中扮演怎樣角色，還有待深入研究。

總之，通過本研究，筆者認(rèn)為抵抗素參與了重癥AP的發(fā)病過程，可能通過促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65的表達(dá)及TNF-α的釋放發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，在伴高脂血癥性重癥AP中，抵抗素的過表達(dá)可能是加重病情的原因之一。

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