Nicastrin在阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)

邱榮暉， 林 仁， 趙小貞， 王 瑋， 朱元貴

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)發(fā)病機(jī)制目前尚未明確。其中，β-淀粉樣蛋白(β-amyloid, Aβ)的毒性學(xué)說是其重要的發(fā)病機(jī)制之一。當(dāng)Aβ沉積在神經(jīng)元或血管時，其毒性可促使神經(jīng)元變性或凋亡，導(dǎo)致腦血管淀粉樣變性或老年斑的發(fā)生，引起神經(jīng)元或突觸損傷等一系列AD的病理變化。Aβ由β淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)通過β分泌酶和γ分泌酶切割產(chǎn)生。單過性跨膜蛋白(Nicastrin，NCT)是γ分泌酶復(fù)合體的重要亞基，參與γ-分泌酶的組裝及穩(wěn)定[1-2]。過度表達(dá)的Nicastrin增加Aβ生成，但并不增強(qiáng)γ-分泌酶的切割活性[3]。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞已被證實(shí)參與AD的發(fā)病過程。異常Aβ的聚集可激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，而激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞反過來促進(jìn)Aβ的沉積，從而形成惡性循環(huán)[4]。Aβ是通過神經(jīng)元的毒性作用間接影響星形膠質(zhì)細(xì)胞，或是APP經(jīng)γ-分泌酶切割形成的Aβ直接影響星形膠質(zhì)細(xì)胞，目前尚不明確。本研究擬應(yīng)用形態(tài)學(xué)研究方法，以同窩5×FAD轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對象，觀察NCT及Aβ在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的分布與表達(dá)，探討其在AD發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1動物及試劑 同窩七月齡雌性小鼠7只(美國Mary Jo Lad教授惠贈)，體質(zhì)量(40±3)g，經(jīng)RT-PCR基因型鑒定APPK70N/M671L(Swedish)+I716V(Florida) +V717I(London)+PS1M146L+L286V(即5×FAD，由福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科曾玉琦博士完成)，其中野生型小鼠3只，突變型4只。一抗：Guinea Pig anti-Nicastrin(加拿大Chemicon公司)；Rabbit Anti-β-Amyloid 1～42(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；Mouse Anti-GFAP(中國邁新生物公司)。二抗：CY3, Goat anti-Rabbit IgG(中國碧云天公司)；CY5, Donkey anti-Guinea Pig IgG(加拿大Chemicon公司)；FITC，Goat anti-Mouse IgG(中國碧云天公司)。激光共聚焦顯微鏡(SP5，德國Leica公司)。

1.2方法 小鼠用4%多聚甲醛經(jīng)左心室灌注固定、取腦、石蠟包埋，10 μm連續(xù)冠狀切片。連續(xù)切片隔十取一，行Nicastrin(1∶400 PBS稀釋)、Aβ(1∶200 PBS稀釋)和GFAP(1∶100 PBS稀釋)免疫熒光三標(biāo)染色，以PBS代替一抗為陰性對照；二抗CY3、CY5、FITC均按1∶500 PBS稀釋。應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡分別在CA1、CA3、DG三個腦區(qū)中固定選取3個不重疊視野進(jìn)行拍照后，觀察三者的位置關(guān)系，出現(xiàn)黃白色或綠白色視為三者共定位，出現(xiàn)粉紅色或紫色視為NCT、Aβ共定位。應(yīng)用Leica AF Lite軟件計(jì)算熒光值進(jìn)行半定量分析。應(yīng)用38×38小格，每小格0.5 cm×0.5 cm的測試網(wǎng)格對GFAP、NCT、Aβ陽性聚集物三者的共定位數(shù)行體視學(xué)計(jì)數(shù)。即分別將各腦區(qū)不同位置的的照片置于網(wǎng)格底面，計(jì)數(shù)各共定位的陽性物與網(wǎng)格十字交叉的重疊數(shù)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有照片在共聚焦激光掃描顯微鏡相同的條件下獲取。對Aβ、NCT、GFAP測平均熒光強(qiáng)度值和共定位陽性物體視學(xué)計(jì)數(shù)后應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包行t檢驗(yàn)分析，P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1Aβ、NCT、GFAP的位置關(guān)系 在野生型和突變型小鼠的CA1、CA3、DG區(qū)的錐體細(xì)胞層中均可見Aβ在細(xì)胞內(nèi)均勻表達(dá)。此外，在突變型CA1和DG區(qū)的錐體細(xì)胞層周圍或錐體細(xì)胞層中，可見較多由Aβ在細(xì)胞外聚積成斑塊，在CA3區(qū)的斑塊較少。在突變型的上述區(qū)域同時可見大小不一的NCT免疫反應(yīng)陽性物表達(dá)，而在野生型中僅可見少量NCT免疫反應(yīng)陽性物出現(xiàn)。在突變型中大部分Aβ陽性聚集物與NCT和GFAP共定位，在它們周圍有GFAP包繞，且GFAP增多，小部分Aβ陽性聚集物僅與GFAP共存。圍繞Aβ陽性聚集物周圍的GFAP突起向斑塊集中，但Aβ陽性反應(yīng)物聚集處突起減少或消失。另外，可見部分NCT陽性反應(yīng)物僅與Aβ共表達(dá)，部分NCT陽性反應(yīng)物單獨(dú)存在于突變型的上述腦區(qū)中(圖1)。

A：野生型小鼠CA1區(qū)；B：突變型小鼠CA1區(qū)；C：野生型小鼠CA3區(qū)；D：突變型小鼠CA3區(qū)；E：野生型小鼠DG區(qū)；F：突變型小鼠DG區(qū). →：免疫反應(yīng)陽性物。Ⅰ,Ⅱ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅶ,Ⅷ：bar=100 μm，Ⅲ,Ⅵ,Ⅸ：bar=50 μm.

2.2Aβ、Nicastrin、星形膠質(zhì)細(xì)胞在野生型小鼠與突變型小鼠海馬區(qū)的分布差異 分別對野生型和突變型CA1、CA3、DG腦區(qū)中的Aβ、Nicastrin、星形膠質(zhì)細(xì)胞熒光半定量后，行組間t檢驗(yàn)分析。CA1區(qū)的t值分別為-3.837，-2.367，-3.413；CA3區(qū)的t值分別為-2.291，-6.150，-3.539；DG區(qū)t值分別為-3.769，-7.698，-3.616，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)；突變型各腦區(qū)中Aβ、Nicastrin、星形膠質(zhì)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度均大于野生型海馬相應(yīng)區(qū)域。

CA1：小鼠海馬第一亞區(qū)；CA3：第三亞區(qū)；DG：齒狀回. A：膠質(zhì)纖維酸性蛋白； B：β-淀粉樣變； C：單過性跨膜蛋白. 與野生型小鼠比較，★：P<0.05.

2.3野生型與突變型小鼠海馬中NCT、GFAP和Aβ共表達(dá)量差異 在突變型小鼠CA1、CA3和DG均可見NCT、GFAP和Aβ三者的免疫反應(yīng)陽性物共定位。野生型中偶爾可見上述三者共定位。經(jīng)體視學(xué)方法分別對2組CA1、DG和CA3三個腦區(qū)中共定位的陽性免疫反應(yīng)物計(jì)數(shù)后，行組間t檢驗(yàn)分析。3個腦區(qū)的t值分別為-5.478，-4.475，-5.415，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)；突變型CA1、DG和CA3中各陽性共定位計(jì)數(shù)均多于野生型小鼠海馬的各相應(yīng)腦區(qū)。

CA1：小鼠海馬第一亞區(qū)；CA3：第三亞區(qū)；DG：齒狀回. GFAP：膠質(zhì)纖維酸性蛋白；Aβ：β-淀粉樣變；NCT：單過性跨膜蛋白. 組間比較，★：P<0.05.

3 討 論

研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞除了具有與小膠質(zhì)細(xì)胞共同構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)的框架細(xì)胞、對神經(jīng)元營養(yǎng)支持的作用外[5]，其在神經(jīng)突觸發(fā)生、突觸調(diào)節(jié)、突觸可塑性中也發(fā)揮重要作用[6]，目前GFAP常作為其主要的標(biāo)記物。另據(jù)報道，在AD的發(fā)病過程中星形膠質(zhì)細(xì)胞可產(chǎn)生Aβ，且能對細(xì)胞外的Aβ進(jìn)行內(nèi)化和攝取，從而在Aβ的清除中起到某種作用[7-9]。本實(shí)驗(yàn)可見，突變型小鼠CA1、CA3、DG等腦區(qū)的星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP熒光強(qiáng)度增高，且發(fā)現(xiàn)有聚集成斑塊的Aβ免疫反應(yīng)陽性物分布于上述腦區(qū)。同時，Aβ免疫反應(yīng)陽性聚集物周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)增多且緊密圍繞。此外，突變型小鼠CA1、CA3、DG中NCT表達(dá)增多，且部分與Aβ共定位于星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物GFAP中。結(jié)合體視學(xué)對Aβ、NCT、GFAP陽性物共定位數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，推測在AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦的星形膠質(zhì)細(xì)胞中有γ-分泌酶表達(dá)，星形膠質(zhì)細(xì)胞中的Aβ可能是由其中的γ-分泌酶剪切APP形成。但有學(xué)者認(rèn)為，AD時神經(jīng)元中的Aβ活化星形膠質(zhì)細(xì)胞，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生和釋放的神經(jīng)遞質(zhì)與毒性代謝產(chǎn)物影響神經(jīng)元的興奮性，進(jìn)而促進(jìn)AD的發(fā)展[10]。但據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合GFAP標(biāo)記陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量與記憶障礙和神經(jīng)元減少密切相關(guān)的報道[11]，可推測AD中星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷可能是由表達(dá)于其本身的Aβ的毒性反應(yīng)和后繼炎性反應(yīng)引起。損傷后的星形膠質(zhì)細(xì)胞無法保護(hù)神經(jīng)元并使之與Aβ分離，從而促進(jìn)AD的發(fā)展。

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