針刺對(duì)糖尿病大鼠下丘腦弓狀核IRS1/PI3K途徑的影響

袁愛(ài)紅 鮑陶陶 倪英群 劉 劍

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，安徽 合肥 210032)

近年研究顯示，胰島素不僅通過(guò)外周機(jī)制調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的儲(chǔ)存和循環(huán)底物的釋放，在大腦中也調(diào)節(jié)各種關(guān)鍵生理功能〔1～4〕。胰島素的中樞作用是肝糖代謝的生理性決定因素，下丘腦胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是肝糖合成所必需的。糖尿病對(duì)中樞胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響尚在研究之中，文獻(xiàn)研究認(rèn)為，胰島素受體底物1-磷脂酰肌醇3激酶-葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(IRS1-PI3K-GLUT4)仍然是最可能的中樞胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑〔5〕。Komori等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)胰島素受體(INSR)和GLUT4高表達(dá)于下丘腦弓狀核，認(rèn)為下丘腦神經(jīng)核團(tuán)存在胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。針灸治療2型糖尿病(T2DM)有良好療效〔7，8〕。既往的研究顯示，針刺對(duì)鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠下丘腦弓狀核INSR有著良性調(diào)整作用〔9〕。在此基礎(chǔ)之上，本研究將對(duì)糖尿病狀態(tài)下的下丘腦弓狀核胰島素IRS1/PI3K信號(hào)通路進(jìn)行探討，同時(shí)探討針刺對(duì)該通路的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 50只220～250 g SD雄性大鼠由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)中心。飼養(yǎng)環(huán)境：12 h光照～12 h黑夜，室溫25℃～27℃，濕度50%。所有大鼠造模期間均自由攝食、飲水，飼料和水每日更換1 次。

1.2造模與分組 根據(jù)體重將大鼠隨機(jī)分為普通飼料組(10只，簡(jiǎn)稱為對(duì)照組)和高糖高脂飼料組(40只)，喂養(yǎng)4 w后，將高糖高脂組大鼠腹腔注射STZ(sigma公司產(chǎn)品)，將STZ溶于0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.4)，配成1%的溶液，以25 mg/kg劑量連續(xù)注射2 d，1 w后檢測(cè)空腹血糖(FPG)，F(xiàn)PG≥7.8 mmol/L即為T2DM大鼠(共20只)〔10〕。將造模成功的T2DM 大鼠隨機(jī)分為針刺組和模型組各10只。

針刺組：將大鼠放入自制大鼠固定器中，75%酒精消毒后三里(相當(dāng)于足三里)、內(nèi)庭和胰俞，用36號(hào)華佗牌美容針?lè)謩e刺入上穴，后三里和胰俞用平補(bǔ)平瀉的捻轉(zhuǎn)手法運(yùn)針1 min，內(nèi)庭穴用捻轉(zhuǎn)瀉法運(yùn)針0.5 min，然后將G6805 Ⅱ型電針儀分別接于后三里和內(nèi)庭穴，采用頻率10 Hz、強(qiáng)度為1 mA 的連續(xù)波，每次選擇一側(cè)肢體的穴位，15 min/次，1次/d，兩側(cè)肢體交替選擇。治療6 d休息1 d，連續(xù)治療4 w。

模型組和對(duì)照組與針刺組同樣固定，但不針刺。在此期間所有大鼠均以SPF級(jí)全價(jià)鼠飼料喂養(yǎng)，自由攝食、飲水。

1.3標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，空腹過(guò)夜，于次日上午8時(shí)，以10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉。剪開(kāi)胸腹腔，暴露心臟，左心室取血5 ml，室溫靜置1 h后，3 000 r/min離心5 min，分離血清置-20℃冰箱保存待測(cè)。斷頭處死，置冰碟上，快速分離下丘腦弓狀核，置液氮中保存。強(qiáng)生血糖儀檢測(cè)FPG，放免法檢測(cè)血清胰島素(FINs)。

1.4實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)下丘腦弓狀核INSR、IRS1、PI3K和GLUT4基因 ①RNA的提取：稱取組織50～100 mg，剪碎，加入1 ml Trizol，使用組織勻漿器在冰上進(jìn)行勻漿。4℃，10 000 r/min離心10 min，以去除未完全裂解的組織以及脂肪等。加入0.2 ml氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置3 min。4℃ 10 000 r/min離心15 min，取上清(約500 μl)加入到另一EP管中。加入0.5 ml異丙醇，溫和混勻，室溫放置10 min。 4℃ 12 000 r/min離心10 min，棄去上清。加入1 ml 75%乙醇(DEPC水配制)。4℃ 7 500 r/min離心5 min，棄上清。室溫放置30 min干燥RNA沉淀。加入20 μl DEPC水，55℃促溶10 min，-80℃保存?zhèn)溆谩?②RT反應(yīng)：在0.2 ml EP管中，加入總RNA 8 μl、10 μmol/L Oligo(dT)1 μl、DEPC水3 μl，輕輕混勻、點(diǎn)動(dòng)離心。PCR儀上65℃加熱5 min，立即冰浴3 min。在上述EP管中加入5×反應(yīng)緩沖液4.0 μl、10 mmol/L dNTP Mix 2 μl、Ribolock TM Rnase inhibitor 1 μl、RevertAidTM M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶1 μl。42℃ 60 min，70℃ 5 min。取出上述反應(yīng)液，即為cDNA，-80℃ 保存?zhèn)溆?。③熒光定量PCR反應(yīng)：取出上述反應(yīng)液2 μl作為模板，反應(yīng)體系：2×Goldstar Taqman mixture 10 μl，正反義引物各10 μmol/L 0.4 μl，探針10 μmol/L 0.4 μl，Template DNA 2 μl，Rnase Free水6.8 μl，反應(yīng)總體積為20 μl；反應(yīng)條件：M-MLV 滅火95℃ 10 min，變性95℃ 15 s，退火60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)觀察CT 值的變化，計(jì)算基因表達(dá)相對(duì)含量，結(jié)果以2-△△CT表示。

根據(jù)GenBank 提供的序列設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)軟件為Primer5，引物及探針由Invitrogen公司合成，實(shí)時(shí)定量PCR 儀為美國(guó)ABI公司的ABI7500，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAidTM first Strand cDNA Synthesis Kit)為Fermentas公司產(chǎn)品(貨號(hào)：00064525)，熒光定量試劑及實(shí)驗(yàn)耗材由TaKaRa公司提供。引物序列：β-actin正義引物5′-ACCAGTTCGCCATGGATGAC-3′，反義引物5′-TGCCGGAGCCGTTGTC-3′，探針5′-ATATCGCTGCGCTCGT-3′ ；INSR正義引物5′-CAGCGTGGCTGCCTACGT-3′，反義引物5′-CAGGGCCAACGATGTCATC-3′，探針5′-CCGGACCATGCCTGA-3′；IRS1正義引物5′-CAGGCAGAATGAAAGACCTAAATG-3′，反義引物5′-AGACGTGAGGTCCTGGTTGTG-3′，探針5′-AATCCTCCTTTTTAACTCATG-3′；PI3K正義引物5′-GTCGGCTGGCGATGCTCAGA-3′，反義引物5′-TACGCACAGGGCCGGGTTCA-3′，探針5′-CATAAGTTTGCCCAGTACT-3′；GLUT4正義引物5′-CTGGGGTGGAACAGCCAGCC-3′，反義引物5′-CCGTCGCCCAGCT CGCTCTA-3′，探針5′-TCAACCAGCATCTTTGAGTT-3′。

1.5Western印跡檢測(cè)下丘腦弓狀核INSR、IRS1、PI3K、GLUT4蛋白 ①組織蛋白提取：剪取組織50 mg，加入RIPA細(xì)胞裂解液100 μl(含1 μmol/L PMSF)進(jìn)行裂解，冰上進(jìn)行組織勻漿。12 000 r/min離心5 min。收集上清液，即含有組織總蛋白。吸取蛋白溶液(約80 μl)，加入5倍蛋白質(zhì)上樣緩沖液20 μl，沸水浴中加熱5 min。②上樣與電泳：配制SDS-PAGE凝膠：濃縮膠2 ml(雙蒸水1.4 ml，30%丙烯酰胺混合液330 μl，1.0 mol Tris(pH6.8)250 μl，10%SDS 20 μl，10%AP 20 μl，TEMED 2 μl)，10%分離膠5 ml(雙蒸水1.9 ml，30%丙烯酰胺混合液1.7 ml，1.5 mol Tris(pH8.8)1.3 ml，10%SDS 50 μl，10%AP 50 μl，TEMED 2 μl)，12%分離膠5 ml(雙蒸水1.6 ml，30%丙烯酰胺混合液2.0 ml，1.5 mol Tris(pH8.8)1.3 ml，10%SDS 50 μl，10%AP 50 μl，TEMED 2 μl。待膠凝固后，拔去梳子，每孔加15 μl蛋白樣品進(jìn)行電泳，其中濃縮膠電壓為70 V，時(shí)間40 min；分離膠電壓為120 V，時(shí)間約1.5 h。③轉(zhuǎn)膜：將預(yù)先裁好與膠條同樣大小的濾紙和PVDF膜(其中PVDF膜預(yù)先在甲醇中浸泡3 min)，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中5 min。轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽(yáng)極板、3層濾紙、PVDF膜、凝膠、3層濾紙、陰極板的順序放好，濾紙、凝膠、PVDF膜精確對(duì)齊，接通電源，恒流轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜條件：β-actin、PI3K和GLUT4均為120 mA 2 h，INSR 180 mA 2 h,IRS1 200 mA 2.5 h。④封閉：轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的TBS洗滌液中，漂洗5 min，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。加入Western封閉液(5%脫脂奶粉)，在搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫封閉2 h。⑤孵育：按照合適的比例用一抗稀釋液進(jìn)行稀釋，4℃ 緩慢搖動(dòng)孵育過(guò)夜(或者常溫2～2.5 h)，加入洗滌液(TBST)20 ml，洗滌10 min，共洗滌3次。按照1∶5 000用二抗稀釋液稀釋辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(β-actin為山羊抗小鼠，其余均為山羊抗兔)，室溫封閉2 h，加入洗滌液(TBST)，每次洗滌10 min，共洗滌3次。⑥蛋白檢測(cè)：使用ECL發(fā)光試劑盒(美國(guó)Pierce公司)檢測(cè)蛋白。采用Quantity one 灰度分析軟件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值的相對(duì)值表示。

2 結(jié) 果

2.1造模及治療后FPG和FINS比較 造模后，模型組和針刺組按FPG水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.073,P=0.943)，說(shuō)明兩組來(lái)自同一樣本，具有可比性。治療后模型組FPG水平明顯高于對(duì)照組(P=0.013)和針刺組(P=0.016)，與治療前比較無(wú)顯著差異(P=0.200)；針刺組FPG與治療前比較顯著降低(P=0.001)，與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P=0.457)。治療后FINS水平，模型組明顯高于對(duì)照組(P=0.008)，針刺組與模型組比較顯著降低(P=0.038)，仍高于對(duì)照組(P=0.036)。見(jiàn)表1。

表1 造模后和治療后FPG水平(mmol/L，n=9)

2.2治療后各組INSR、IRS1、PI3K 和GLUT4蛋白含量 圖1，表2可見(jiàn)，對(duì)照組INSR蛋白表達(dá)顯著高于模型組和針刺組(P分別為0.000和0.012)，針刺組INSR蛋白表達(dá)顯著高于模型組(P=0.006)；對(duì)照組IRS1蛋白表達(dá)顯著高于模型組和針刺組(P=0.000)，針刺組IRS1蛋白表達(dá)顯著高于模型組(P=0.029)；對(duì)照組PI3K蛋白表達(dá)顯著高于模型組及針刺組(P=0.000)，針刺組PI3K蛋白表達(dá)顯著高于模型組(P=0.020)；對(duì)照組GLUT4蛋白表達(dá)顯著高于模型組及針刺組(P=0.000)，針刺組GLUT4蛋白表達(dá)顯著高于模型組(P=0.041)。

圖1 Western印跡檢測(cè)各組INSR、IRS1、PI3K、GLUT4蛋白表達(dá)

2.3治療后各組INSR、IRS1、PI3K和GLUT4 基因表達(dá)情況 對(duì)照組各基因表達(dá)設(shè)為1。治療后，模型組INSR mRNA表達(dá)是對(duì)照組的0.05倍，針刺組INSR mRNA比模型組增加，但仍低于對(duì)照組，是對(duì)照組的0.43 倍。模型組IRS1 mRNA表達(dá)是對(duì)照組的0.65倍，針刺組IRS1 mRNA比模型組增加，但仍低于對(duì)照組，是對(duì)照組的0.89倍。模型組PI3K mRNA表達(dá)是對(duì)照組的0.74倍，針刺組PI3K mRNA比模型組增加，但仍低于對(duì)照組，是對(duì)照組的0.88倍。模型組GLUT4 mRNA表達(dá)是對(duì)照組的0.72倍，針刺組GLUT4 mRNA比模型組增加，但仍低于對(duì)照組，是對(duì)照組的0.93倍。

表2 治療后各組INSR、IRS1、PI3K和GLUT4蛋白含量±s,n=9)

3 討 論

胰島素是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種主要調(diào)節(jié)物質(zhì)〔11〕，對(duì)于能量代謝平衡、神經(jīng)突觸重塑、學(xué)習(xí)、記憶、肝糖代謝有著重要作用。腦內(nèi)胰島素通過(guò)與INSR的結(jié)合發(fā)揮各種生理作用，INSR 和GLUT4豐富地表達(dá)于嗅球、大腦皮質(zhì)、下丘腦、海馬、小腦等部位。IRS1不僅在外周組織的胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，在大腦許多部位也有廣泛表達(dá)，有學(xué)者推測(cè)IRS1/PI3K是腦內(nèi)胰島素作用的最可能信號(hào)途徑〔5〕；該信號(hào)通路的紊亂會(huì)導(dǎo)致中樞胰島素抵抗，從而引起糖尿病、癡呆、神經(jīng)變性紊亂等多種疾病的發(fā)生。胰島素對(duì)神經(jīng)功能調(diào)節(jié)的最直接機(jī)制可能是通過(guò)對(duì)糖代謝的調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)的，胰島素信號(hào)異常導(dǎo)致糖代謝調(diào)節(jié)紊亂直接影響神經(jīng)系統(tǒng)的功能。一些研究顯示，向海馬注射胰島素能夠引起局部糖酵解的迅速增加并維持在高位，但這種作用在2型糖尿病動(dòng)物則完全削弱，其機(jī)制可能與PI3K信號(hào)通路的紊亂有關(guān)。有報(bào)道顯示，肥胖的Zucker大鼠胰島素誘導(dǎo)的INSR/IRS1的磷酸化降低〔12〕。

本研究提示，STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型大鼠存在高胰島素血癥，下丘腦弓狀核的INSR、IRS1、PI3K、GLUT4基因表達(dá)及蛋白含量降低，提示存在中樞胰島素抵抗。針刺組大鼠高胰島素血癥有所改善，下丘腦弓狀核的INSR、IRS1、PI3K、GLUT4基因表達(dá)及蛋白含量均比模型組增加，提示針刺能夠改善STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。這與我們既往的研究結(jié)果相符合〔9〕。本研究顯示，糖尿病狀態(tài)下INSR/IRS1/PI3K/GLUT4通路的每個(gè)環(huán)節(jié)在基因和蛋白水平上均明顯下降，而針刺后該通路各個(gè)環(huán)節(jié)的基因和蛋白水平均增加，筆者以為這個(gè)結(jié)果可以作為INSR/IRS1/PI3K/GLUT4是大腦胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑的一個(gè)佐證。盡管胰島素的中樞作用和外周作用對(duì)糖代謝的調(diào)節(jié)是相反的，但針刺對(duì)糖尿病大鼠中樞胰島素抵抗的改善必然對(duì)肝糖代謝及能量平衡產(chǎn)生良性影響，這可能是針刺降糖的機(jī)制之一。

研究顯示，糖尿病患者會(huì)出現(xiàn)記憶力下降、認(rèn)知減退，中樞胰島素抵抗在其中發(fā)揮了重要影響〔5〕。本研究顯示了針刺改善中樞胰島素抵抗的良好作用，那么針刺是否對(duì)糖尿病患者的記憶力下降、認(rèn)知減退以及阿爾茨海默病有所裨益，有待今后進(jìn)一步研究。

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