丹蛭降糖膠囊對(duì)糖尿病大鼠血清TNF-α和CXCL-5的影響

劉珊珊，李中南，許成群，熊園園，張 帆

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031；2. 淮北市中醫(yī)醫(yī)院，安徽 淮北 235000)

丹蛭降糖膠囊對(duì)糖尿病大鼠血清TNF-α和CXCL-5的影響

劉珊珊1，李中南1，許成群2，熊園園1，張 帆1

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031；2. 淮北市中醫(yī)醫(yī)院，安徽 淮北 235000)

目的觀察丹蛭降糖膠囊對(duì)糖尿病大鼠血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha， TNF-α)和趨化因子(C-X-C基序)配基5(chemokine (C-X-C motif) ligand 5，CXCL-5)表達(dá)的影響，探究其降糖作用機(jī)制。方法將健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組，模型組，吡格列酮組，丹蛭降糖膠囊高、低劑量組。采用鏈尿佐菌素單次腹腔注射法復(fù)制糖尿病模型，采用雙抗體夾心法測(cè)定大鼠血清TNF-α、CXCL-5水平。結(jié)果與模型組比較，吡格列酮組和丹蛭降糖膠囊高、低劑量組TNF-α、CXCL-5水平顯著降低(P<0.01)，3個(gè)給藥組TNF-α、CXCL-5比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型復(fù)制后0周末比較，2、4、8周末，吡格列酮組和丹蛭降糖膠囊高、低劑量組血糖水平均顯著降低(P<0.01)。2、4、8周末，與模型組比較，吡格列酮組及丹蛭降糖膠囊高、低劑量組血糖水平均顯著降低(P<0.01)，但3個(gè)給藥組之間血糖水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Pearson相關(guān)分析顯示，8周末血糖水平與TNF-α、CXCL-5均呈正相關(guān)(P<0.01)。結(jié)論丹蛭降糖膠囊降低糖尿病大鼠血糖的機(jī)制與其降低血清TNF-α、CXCL-5水平有關(guān)。

糖尿??；益氣養(yǎng)陰活血法；丹蛭降糖膠囊；TNF-α；CXCL-5

隨著人們生活水平的提高，糖尿病(diabetes mellitus，DM)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，既往胰島素抵抗(insulin resistance, IR)和胰島素分泌不足被認(rèn)為是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)發(fā)病機(jī)制的兩個(gè)方面[1]。但近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，T2DM的發(fā)病機(jī)制可能是由細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，是一種先天的免疫性疾病，炎癥在T2DM的發(fā)病機(jī)制中起著重要的媒介作用[2]。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)是炎性因子的重要指標(biāo)[3]，趨化因子參與白細(xì)胞遷移調(diào)控，在炎癥中誘導(dǎo)性表達(dá)，與炎癥過(guò)程密切相關(guān)[4]。本研究通過(guò)檢測(cè)DM模型大鼠TNF-α和趨化因子(C-X-C基序)配基5(chemokine (C-X-C motif) ligand 5，CXCL-5)的表達(dá)水平及丹蛭降糖膠囊干預(yù)后的變化，探討丹蛭降糖膠囊的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠55只，體質(zhì)量(200±20)g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(皖)2012-2013。大鼠一般狀況良好，毛發(fā)旺盛有光澤，活動(dòng)正常，反應(yīng)靈敏。

1.2 藥物及試劑 丹蛭降糖膠囊(每粒0.35 g，由太子參、生地黃、牡丹皮、澤瀉、水蛭等組成，批號(hào) 030125)：由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥制劑中心提供；吡格列酮(每片15 mg，批號(hào) Hz0050500)：杭州中美華東制藥有限公司；鏈脲佐菌素(streptozocin, STZ)：美國(guó)Sigma公司，批號(hào) s0130；CXCL-9試劑盒：南京建成公司，批號(hào) E-31225；TNF-α試劑盒：上海源葉生物技術(shù)有限公司，批號(hào) 130529R。

1.3 主要儀器 RT-6000型酶標(biāo)儀：雷杜有限公司；GL-88B型漩渦混合器：其林貝爾儀器制造公司；DNP-9052BS-Ⅲ型電熱恒溫箱：上海三發(fā)廠；血糖監(jiān)測(cè)儀：美國(guó)強(qiáng)生公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型復(fù)制 健康雄性SD大鼠55只，用基礎(chǔ)飼料(蛋白質(zhì)25%，碳水化合物60%，脂肪5%，其他10%)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選出10只作為正常對(duì)照組，其余動(dòng)物一次性腹腔注射STZ 35 mg/kg(使用前以pH 4.4的0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液新鮮配制)，120 h后尾靜脈取血，以隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L為模型復(fù)制成功[5]。

2.2 動(dòng)物分組與給藥 模型復(fù)制成功后，將DM大鼠隨機(jī)分為模型組12只，吡格列酮組(10 mg/kg)，丹蛭降糖膠囊高劑量組(1.08 g/kg)、低劑量組(0.54 g/kg)組各11只，均予以高脂飼料(基礎(chǔ)飼料加豬油、麻油、雞蛋和花生等混合而成，在1 000 g基礎(chǔ)飼料中加入食鹽150 g、白糖50 g、豬油1 000 g、麻油400 g、雞蛋900 g。碳水化合物20%，含蛋白質(zhì)30%、脂肪40%、其他10%)喂養(yǎng)，正常對(duì)照組以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。3個(gè)藥物組均按5 mL/kg灌胃給藥，正常對(duì)照組和模型組均給予生理鹽水5 mL/kg，每日1次，連續(xù)灌胃8周。于第2、4、8周末尾靜脈采血測(cè)隨機(jī)血糖，處死前一天禁食不禁水，3%水合氯醛10 mg/kg腹腔注射麻醉，迅速抽取腹主動(dòng)脈血，冷凍保存。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清TNF-α和CXCL-5水平。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，1只大鼠未被復(fù)制成DM模型，3只大鼠因血糖過(guò)高死亡，3只大鼠因皮膚感染死亡，2只大鼠因互相打斗死亡。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠TNF-α和CXCL-5水平比較 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清TNF-α、CXCL-5水平顯著升高(P<0.01)。灌胃藥物8周后，與模型組比較，丹蛭降糖膠囊高、低劑量組TNF-α、CXCL-5水平顯著降低(P<0.01)。吡格列酮組與丹蛭降糖膠囊高、低劑量組TNF-α、CXCL-5水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠TNF-α和CXCL-5水平比較

注：“丹蛭”即“丹蛭降糖膠囊”之簡(jiǎn)稱(chēng)；與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。

3.2 丹蛭降糖膠囊對(duì)大鼠隨機(jī)血糖的影響 與模型復(fù)制后0周末比較，2、4、8周末，模型組血糖水平均無(wú)顯著變化(P>0.05)，吡格列酮組和丹蛭降糖膠囊高、低劑量組血糖水平均顯著降低(P<0.01)。模型組各時(shí)點(diǎn)血糖水平均顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)。模型復(fù)制后2、4、8周末，吡格列酮組及丹蛭降糖膠囊高、低劑量組血糖水平均較模型組顯著降低(P<0.01)；但2、4、8周末3個(gè)給藥組之間血糖水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血糖水平比較

注：“丹蛭”即“丹蛭降糖膠囊”之簡(jiǎn)稱(chēng)；與模型復(fù)制后0周末比較，△△P<0.01；與同時(shí)點(diǎn)正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與同時(shí)點(diǎn)模型組比較，##P<0.01。

3.3 血糖與TNF-α、CXCL-5的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，8周末血糖水平與血清TNF-α水平呈顯著正相關(guān)(r=0.815，P<0.01)，與血清CXCL-5水平也呈顯著正相關(guān)(r=0.777，P<0.01)。

4 討論

DM是由于體內(nèi)胰島素分泌絕對(duì)或相對(duì)不足而引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂，并具有遺傳傾向性的疾病[6]。目前，有學(xué)者研究認(rèn)為T(mén)2DM不僅是一種內(nèi)分泌疾病，也是一種免疫和低度炎性疾病，炎癥在T2DM的發(fā)病機(jī)制中起媒介作用，故炎性因子TNF-α、CXCL-5能夠預(yù)測(cè)T2DM并發(fā)癥的出現(xiàn)[2]。

TNF-α是一種由單核巨噬細(xì)胞等分泌的具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞也可合成和分泌，其可使炎性細(xì)胞聚集與黏附、微血管擴(kuò)張、通透性增加，誘發(fā)炎性反應(yīng)，參與腎小球損傷[7]。TNF-α還可直接作用于胰島β細(xì)胞，造成胰島β細(xì)胞損傷，進(jìn)而誘發(fā)IR，致DM發(fā)生，也可刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生超氧化物，引起腎臟損傷[8]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清TNF-α水平明顯高于正常對(duì)照組，治療8周末，丹蛭降糖膠囊高、低劑量組TNF-α水平顯著降低，提示丹蛭降糖膠囊可抑制DM模型大鼠血清TNF-α的高表達(dá)，其作用機(jī)制可能與益氣養(yǎng)陰活血的組方成分有關(guān)。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，活血藥丹皮酚能下調(diào)TNF-α的高表達(dá)，減輕炎性反應(yīng)[9]。水蛭能逆轉(zhuǎn)凝血酶導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，水蛭提取液對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用，從而抑制其分泌TNF-α[10]。益氣藥太子參能夠降低TNF-α水平[11]。養(yǎng)陰藥生地黃對(duì)甲醛致大鼠足腫脹有顯著的消腫作用[12]。補(bǔ)腎藥菟絲子黃酮對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放的TNF-α有明顯的抑制作用[13]。由此分析，丹蛭降糖膠囊可能通過(guò)保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，抑制TNF-α的高表達(dá)而抑制炎性反應(yīng)，保護(hù)胰島β細(xì)胞，達(dá)到治療DM的目的。

趨化因子是一組能夠趨化細(xì)胞定向移動(dòng)的小分子細(xì)胞因子，可吸引免疫細(xì)胞到達(dá)免疫應(yīng)答局部，并參與免疫調(diào)節(jié)和免疫病理反應(yīng)。CXCL-5是趨化因子(β型)亞家族的成員之一，可調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌，是一種參與免疫調(diào)節(jié)及炎癥過(guò)程的分泌蛋白[4]。CXCL-5可以激活和誘導(dǎo)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在胰腺郎格罕小島的募集，誘發(fā)TNF-α的釋放，在胰島局部形成炎性反應(yīng)，損傷胰島β細(xì)胞的分泌功能。研究發(fā)現(xiàn)，胰腺組織表達(dá)的CXCL-5與胰島β細(xì)胞功能呈負(fù)相關(guān)，T2DM患者外周血CXCL-5濃度增加時(shí)，應(yīng)用胰島素治療后血清CXCL-5水平明顯下降[14]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠血清CXCL-5水平較正常對(duì)照組顯著升高(P<0.01)，丹蛭降糖膠囊高、低劑量組CXCL-5水平顯著降低，提示丹蛭降糖膠囊能夠明顯抑制CXCL-5的高表達(dá)。研究顯示丹皮酚能通過(guò)提高白細(xì)胞分化抗原4(cluster of differentiation，CD4+)T細(xì)胞數(shù)目和修復(fù)CD4+/CD8+的比值來(lái)調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群的數(shù)目和比例，進(jìn)而改善細(xì)胞免疫應(yīng)答[15]。養(yǎng)陰藥生地黃在體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)中均能明顯提高正常小鼠T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)能力，顯示明顯的免疫調(diào)節(jié)活性[16]。太子參水煎劑有明顯的刺激淋巴細(xì)胞增殖作用，能夠增加小鼠免疫器官的質(zhì)量，增強(qiáng)免疫力[11]。菟絲子可使正常雌性小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖和腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能增強(qiáng)，從而提高免疫力[12]。丹蛭降糖膠囊可能通過(guò)調(diào)節(jié)T細(xì)胞的增殖反應(yīng)能力，增強(qiáng)大鼠免疫力，從而抑制CXCL-5的高表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，模型復(fù)制后，模型組，丹蛭降糖膠囊高、低劑量組，吡格列酮組血糖均顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)，灌胃藥物2周末，丹蛭降糖膠囊高、低劑量組血糖明顯下降(P<0.01)，4周、8周末血糖下降平穩(wěn)，與以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[17]。證實(shí)丹蛭降糖膠囊降糖效果穩(wěn)定。經(jīng)Pearson相關(guān)分析，TNF-α、CXCL-5水平均與血糖水平呈正相關(guān)。TNF-α、CXCL-5參與DM的發(fā)生發(fā)展，丹蛭降糖膠囊在降低血糖的同時(shí)，可明顯降低TNF-α及CXCL-5水平。由此推測(cè)，丹蛭降糖膠囊可能通過(guò)下調(diào)炎性因子水平，抑制炎性反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫功能，降低血糖，達(dá)到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。

[1]黃麗芳，榮海欽，季虹，等.2型糖尿病患者治療后血清內(nèi)臟脂肪素水平的變化及其與炎癥因子的關(guān)系[J].中國(guó)糖尿病雜志，2010，18(6)：424-426.

[2]沈寒蕾，賴(lài)戰(zhàn)峰，譚曉丹，等.2型糖尿病患者血漿內(nèi)脂素與炎癥因子的相關(guān)性研究[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2012，22(7)：44-47.

[3]陳云亞.前列地爾對(duì)早期糖尿病腎病患者血清相關(guān)炎癥因子的影響[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，19(12)：1685-1687，1690.

[4]李桂林，梁尚棟.趨化因子5及其受體CCR5與糖尿病并發(fā)癥[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(10)：1333-1337.

[5]丁艷，劉金玲，張潔，等.清熱祛濕方對(duì)2型糖尿病胰島素抵抗模型大鼠TNF-α影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2010,8(1)：75-77.

[6]張晨君，鄭智紅，木尼拉.糖尿病合并冠心病患者冠狀動(dòng)脈病變與頸動(dòng)脈超聲的關(guān)系[J].實(shí)用心腦肺血管病雜志，2009,17(4)：243-245.

[7]毛春譜，李小毅，張紅梅，等.銀杏葉提取物對(duì)早期糖尿病腎病患者IL-6、TNF-α的影響[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，35(6)：842-844.

[8]季偉峰，吳曉燕.血清hs-CRP、IL-6、TNF-α水平在糖尿病腎病患者中的變化及意義[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2010，20(9)：2143-2145.

[9]Cao W, Zhang W, Liu J, et al. Paeoniflorin improves survival in LPS-challenged mice through the suppression of TNF-alpha and IL-1 beta release and augumentation of IL-10 production[J]. Int Immunopharmacol, 2010, 11(2):172-178.

[10]楊洪雁，杜智恒，白秀娟.水蛭藥理作用的研究進(jìn)展[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，43(3)：128-133．

[11]傅興圣，劉訓(xùn)紅，許虎，等.太子參研究現(xiàn)狀與研發(fā)趨勢(shì)[J].中國(guó)新藥雜志，2012,21(7)：757-760.

[12]王溶生.中藥藥理與應(yīng)用[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1983：493.

[13]郝智.菟絲子黃酮的研究近況[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥,2012,31(17)：134-135.

[14]Jeong KH, Moon JY, Chung JH, et al. Significant associations between CCL5 gene polymorphisms and post-transplantational diabetes mellitus in korean renal allograft recipients [J].Am J Nephrol,2010,32(4)：356-361.

[15]王建杰，董航，羅文哲，等.丹皮酚對(duì)EMT6乳腺癌小鼠免疫功能的影響[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013,10(27)：17-19.

[16]魏桂芳，劉雪萍，何希瑞.地黃藥理與臨床應(yīng)用[J].陜西中醫(yī),2013,34(8)：1073，1096.

[17]吳元潔，方朝暉，鄭書(shū)國(guó)，等.丹蛭降糖膠囊聯(lián)合運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病大鼠胰腺氧化應(yīng)激及胰島功能的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012,32(11)：1531-1534.

EffectsofDanzhiJiangtangCapsuleonSerumLevelsofTumorNecrosisFactorAlphaandChemokine(C-X-CMotif)Ligand5inDiabeticRats

LIUShan-shan1,LIZhong-nan1,XUCheng-qun2,XIONGYuan-yuan1,ZHANGFan1

(1.TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230031,China; 2.HuaibeiMunicipalHospitalofTraditionalChineseMedicine,AnhuiHuaibei235000,China)

ObjectiveTo observe the effects of Danzhi Jiangtang Capsule on serum levels of tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and chemokine (C-X-C motif) ligand 5 (CXCL-5) in diabetic rats and to investigate the antidiabetic mechanism of Danzhi Jiangtang Capsule.MethodsHealthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control group, model group, pioglitazone group, and high- and low-dose Danzhi Jiangtang Capsule groups. All rats except those in the normal control group were given streptozotocin by a single intraperitoneal injection to induce a diabetes model. Double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay was used to determine serum levels of TNF-α and CXCL-5.ResultsCompared with the model group, the pioglitazone group and high- and low-dose Danzhi Jiangtang Capsule groups had significantly reduced TNF-α and CXCL-5 levels (P<0.01), but TNF-α and CXCL-5 levels showed no significant differences between the three treated groups (P>0.05). Compared with those at 0 week after the model was induced, the blood glucose levels of the pioglitazone and high- and low-dose Danzhi Jiangtang Capsule groups at the ends of the 2nd, 4th, and 8th weeks were significantly reduced (P<0.01). At the ends of the 2nd, 4th, and 8th weeks, the pioglitazone group and high- and low-dose Danzhi Jiangtang Capsule groups had significantly lower blood glucose levels than the model group (P<0.01), but blood glucose levels showed no significant differences between the three treated groups (P>0.05). Pearson correlation analysis showed that blood glucose level was positively correlated with TNF-α and CXCL-5 at the end of the 8th week (P<0.01).ConclusionFor diabetic rats, the antidiabetic mechanism of Danzhi Jiangtang Capsule involves reducing serum TNF-α and CXCL-5 levels.

diabetes; Qi-tonifying, yin-nourishing, and blood-activating therapy; Danzhi Jiangtang Capsule; tumor necrosis factor alpha; chemokine (C-X-C motif) ligand 5

國(guó)家中醫(yī)臨床研究基地業(yè)務(wù)建設(shè)科研專(zhuān)項(xiàng)(JDZX2012004)

劉珊珊(1990-)，女，碩士研究生

李中南，lzn5151307@sohu.com

R587；R285.5

A

10.3969/j.issn.2095-7246.2014.06.019

2014-05-14)