高效液相色譜法測(cè)定不同加工工藝天麻中天麻素和天麻苷元含量

沈肖晶，金傳山，許鳳清，李保明，胡 雨

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230012；3.安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司,安徽 亳州 236800)

高效液相色譜法測(cè)定不同加工工藝天麻中天麻素和天麻苷元含量

沈肖晶1,2，金傳山1,2，許鳳清1,2，李保明3，胡 雨1,2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230012；3.安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司,安徽 亳州 236800)

目的建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定天麻中天麻素及天麻苷元含量的方法，優(yōu)選不同產(chǎn)地的天麻加工工藝。方法采用高效液相色譜法測(cè)定天麻素和天麻苷元含量，色譜柱為Spursil C18-EP(250 mm×4.6 mm)，流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水(5∶95)，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm,柱溫40 ℃，流速1 mL/min。結(jié)果隔水蒸30 min、清水煮15 min、0.2%礬水煮15 min、煮后直接切片是4種較佳的加工工藝，所制得的天麻飲片中天麻素和天麻苷元含量依次降低。結(jié)論隔水蒸30 min所制得的天麻飲片中天麻素及天麻苷元含量最高，優(yōu)于其他處理方法。

天麻；天麻素；天麻苷元；加工工藝；高效液相色譜法

天麻為蘭科植物天麻GastradiaelataBl.的干燥塊莖，是我國(guó)傳統(tǒng)的常用名貴中藥材，被歷版《中華人民共和國(guó)藥典》所收錄，亦為安徽的大宗藥材之一。天麻有“治風(fēng)之神藥”之稱，具有平肝熄風(fēng)止痙的作用，主要用于頭痛眩暈、小兒驚風(fēng)、破傷風(fēng)、肢體麻木、癲癇抽搐等癥[1]。目前，天麻傳統(tǒng)產(chǎn)地加工方法主要有隔水蒸法、水煮法與礬煮法等，多依據(jù)藥農(nóng)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行加工，其質(zhì)量參差不齊。

天麻素(對(duì)羥基苯甲醇-β-D-吡喃葡萄糖苷)具有鎮(zhèn)靜催眠、鎮(zhèn)痛、抗癲癇等作用[2]，一直被公認(rèn)為是天麻的有效成分和質(zhì)量控制的主要指標(biāo)成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，天麻中天麻素、天麻苷元(對(duì)羥基苯甲醇)等成分具有抗驚厥、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、提高記憶力等生物活性[3]。而早期研究多僅僅選擇天麻素作為質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)[4-5]，鮮見(jiàn)同時(shí)測(cè)定天麻素及天麻苷元以比較天麻加工工藝的文獻(xiàn)[6]。故本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜技術(shù)，建立同時(shí)測(cè)定天麻中天麻素及天麻苷元的方法，同時(shí)比較隔水蒸法、清水煮法、礬水煮法等不同參數(shù)條件下的加工方法對(duì)這兩種成分的影響，為天麻加工工藝研究提供基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Shimadzu LC-20AT型高效液相色譜儀(含LC-20AT泵、SPD20M檢測(cè)器、天津東康DT-230A型柱溫箱、LC-Solution工作站)；Spursil C18-EP色譜柱：美國(guó)迪馬公司；AT系列溶劑過(guò)濾器、AS3120型超聲清洗儀：天津Autoscience公司；MS105/0.01 mg電子天平：上海梅特勒托利多公司；CP225D型十萬(wàn)分之一電子天平：德國(guó)Sartorius公司；202-2型電熱恒溫干燥箱：上海實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；LK-400B型粉碎機(jī)：浙江溫嶺創(chuàng)新藥材器械廠；2SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵：河南鄭州長(zhǎng)城工貿(mào)有限公司；HH-S2系列恒溫水浴鍋：江蘇金壇環(huán)宇科學(xué)儀器廠。

1.2 試藥 天麻素標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào) 110807-200205；天麻苷元對(duì)照品：純度98%，Adamas試劑公司；甲醇：色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司生產(chǎn)，批號(hào) 401321；磷酸：分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào) 20100313；純凈水：杭州娃哈哈有限公司生產(chǎn)，批號(hào) 121530；天麻鮮品：2013年12月采于安徽省安慶市岳西縣石關(guān)鄉(xiāng)馬畈村，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院金傳山教授鑒定為天麻G.elataBl.的干燥塊莖。

2 方法

2.1 色譜條件 采用Spursil C18-EP色譜柱(250 mm×4.6 mm)，流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水(5∶95)，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，流速1 mL/min，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。該條件下天麻素與天麻苷元分離度良好，見(jiàn)圖1、圖2。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取80 ℃減壓干燥1 h的天麻素對(duì)照品9.95 mg、天麻苷元對(duì)照品2.74 mg，流動(dòng)相定容至25 mL容量瓶，混勻過(guò)0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取各樣品粉末(24目)1 g，溶于70%甲醇，定容至25 mL容量瓶，超聲20 min，取出放冷后精密移取10 mL，置潔凈干燥蒸發(fā)皿中水浴濃縮至近干，殘?jiān)苡诹鲃?dòng)相，定容至10 mL容量瓶，搖勻，過(guò)0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液，即得。

圖1 天麻素及天麻苷元高效液相色譜圖圖2天麻藥材高效液相色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察 精密移取天麻素與天麻苷元混合對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法制備，分別取0.05、0.2、0.5、1、2、3、5 mL混合對(duì)照品溶液，流動(dòng)相定容至5 mL容量瓶中，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以對(duì)照品濃度(x)為橫坐標(biāo)，峰面積(y)為縱坐標(biāo)，得天麻素線性方程為y=3.6×107x+122 715，r=0.999 8，線性范圍為0.020 0～1.990 0 mg；天麻苷元線性方程為y=7.1×107x-70 748，r=0.999 3，線性范圍為0.005 5～0.548 0 mg。在此范圍內(nèi)天麻素及天麻苷元線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 取天麻素和天麻苷元混合對(duì)照溶液，按“2.1”項(xiàng)下操作，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定天麻素、天麻苷元含量，天麻素和天麻苷元含量的RSD分別為0.16%、0.33%，符合定量分析要求。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取樣品粉末，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定樣品中天麻素和天麻苷元含量，天麻素和天麻苷元含量的RSD分別為1.02%、1.19%，符合定量分析要求。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 稱取樣品粉末，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定樣品中天麻素和天麻苷元含量，天麻素和天麻苷元含量的RSD分別為0.88%、0.92%，說(shuō)明供試品在24 h內(nèi)質(zhì)量穩(wěn)定。

2.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品粉末6份，每份0.5 g，加入適量的天麻素和天麻苷元對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，測(cè)定天麻素和天麻苷元含量。天麻素和天麻苷元平均回收率分別為100.98%、104.28%，RSD分別為1.62%、1.72%，說(shuō)明該方法回收率良好。見(jiàn)表1。

3 不同工藝加工的天麻中天麻素和天麻苷元含量測(cè)定

3.1 樣品加工方法 將新鮮天麻樣品洗凈，大小分級(jí)，選取100～150 g天麻，分別進(jìn)行如下加工。

3.1.1 隔水蒸法：取適量天麻置蒸籠上隔水蒸，圓氣后開(kāi)始計(jì)時(shí)，分別蒸10、15、20、30 min，取出置烘箱中50 ℃烘干。

表1 天麻素、天麻苷元加樣回收率

3.1.2 清水煮法：取適量天麻置清水中，清水淹沒(méi)天麻，保持微沸，分別煮制10、15、20、25、30 min，撈出瀝干表面水分，置烘箱中50 ℃烘干。

3.1.3 礬水煮法：分別配制濃度為0.2%、0.5%、1%、2%、4%的白礬溶液，取適量天麻置白礬溶液中，溶液浸沒(méi)天麻，保持微沸15 min，撈出瀝干表面水分，置烘箱中50 ℃烘干。

3.1.4 直接切片：分別對(duì)天麻水煮15 min后切片、新鮮天麻切片后水煮10 min、新鮮天麻切片后隔水蒸10 min、新鮮天麻切片后4%礬水煮20 min。

3.2 供試品測(cè)定 取不同加工工藝的天麻樣品，編號(hào)，干燥，粉碎，取過(guò)24目不過(guò)60目的粉末，精密稱取1 g，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，分別計(jì)算樣品中天麻素和天麻苷元含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)中考察了純甲醇超聲法、70%甲醇超聲法和50%乙醇熱回流法[7-8]等樣品制備方法，對(duì)于同一樣品，70%甲醇超聲法提取率約為回流法的80%，純甲醇超聲提取率約為回流法的25%。雖然提取率不及回流法，但超聲法具有省時(shí)、簡(jiǎn)便、易操作的優(yōu)點(diǎn)，故選用70%甲醇超聲法制備樣品。

綜合樣品含量測(cè)定結(jié)果，經(jīng)過(guò)不同工藝處理的天麻中天麻素及天麻苷元含量差別較大，天麻素含量最高達(dá)0.82%，最低只有0.19%；天麻苷元含量最高達(dá)0.12%，最低僅為0.01%。從樣品中天麻素及天麻苷元的含量來(lái)看，隔水蒸法要高于清水煮法，與大多文獻(xiàn)報(bào)道一致，且隔水蒸30 min的天麻素含量明顯高于其他，是否30 min為蒸制的最佳時(shí)間有待于進(jìn)一步研究。

表2 各樣品中天麻素與天麻苷元含量(n=3)

結(jié)合表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)選各工藝最佳參數(shù)，隔水蒸30 min、清水煮15 min、0.2%礬煮15 min、煮后直接切這4種工藝所制得的天麻飲片中天麻素及天麻苷元含量較高，具體工藝參數(shù)有待進(jìn)一步研究。不同工藝炮制前后含量變化差別較大，直接切的樣品含量下降較顯著，隔水蒸的樣品含量上升較明顯。從含量變化趨勢(shì)來(lái)看，隔水蒸法較穩(wěn)定，清水煮法變化不成規(guī)律，較容易受水量、溫度、時(shí)間的影響。

本實(shí)驗(yàn)比較了不同濃度白礬溶液煮制天麻的成分差異，結(jié)果顯示在一定范圍內(nèi)，礬水濃度越高，天麻素含量越低；而天麻苷元變化不成規(guī)律，但與清水煮的天麻比較，其天麻苷元含量明顯升高，其中2%礬水煮制天麻中天麻苷元含量最高，這一規(guī)律是否成立有待深入研究。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，0.1%礬水煮制天麻的色澤較差，且存儲(chǔ)時(shí)較易被蟲(chóng)蛀，存儲(chǔ)時(shí)間遠(yuǎn)低于0.2%及以上濃度礬水煮制的樣品，故本實(shí)驗(yàn)中未考察0.1%礬水煮制的樣品。

綜上所述，不同加工工藝所制得的天麻中天麻素及天麻苷元含量存在差異，隔水蒸30 min、清水煮15 min、0.2%礬水煮15 min、煮后直接切片是4種較佳的加工工藝，所制得的天麻飲片中天麻素和天麻苷元含量依次降低。本研究可為天麻產(chǎn)地加工工藝的規(guī)范化研究與參數(shù)的進(jìn)一步優(yōu)選提供依據(jù)。

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SimultaneousDeterminationofGastrodinandp-HydroxybenzylAlcoholinGastrodiaelataProcessedwithDifferentMethodsbyHigh-performanceLiquidChromatography

SHENXiao-jing1,2,JINChuan-shan1,2,XUFeng-qing1,2,LIBao-ming3,HUYu1,2

(1.SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 2.SynergeticInnovationCenterofAnhuiAuthenticChineseMedicineQualityImprovement,AnhuiHefei230012,China; 3.AnhuiXiehechengCo.,Ltd.,AnhuiBozhou236800,China)

ObjectiveTo establish a method for simultaneous determination of gastrodin and p-hydroxybenzyl alcohol inGastrodiaelataby high-performance liquid chromatography (HPLC) and to optimize the processing ofGastrodiaelatafrom different habitats.MethodsHPLC was performed on a Spursil C18-EP column (250 mm × 4.6 mm) with a mobile phase of methanol-0.1% phosphoric acid (5∶95) at a detection wavelength of 220 nm, a column temperature of 40 ℃, and a flow rate of 1 mL/min.ResultsThe content of gastrodin and p-hydroxybenzyl alcohol inGastrodiaelatadecoction pieces was highest afterGastrodiaelatawas processed by water steaming for 30 min, followed by decoction in clear water for 15 min, decoction in 0.2% alum solution for 15 min, and slicing after decoction.ConclusionGastrodiaelatais optimally processed by water steaming for 30 min, and theGastrodiaelatadecoction pieces produced by this method have the highest content of gastrodin and p-hydroxybenzyl alcohol.

Gastrodiaelata; gastrodin; p-Hydroxybenzyl alcohol; process; high-performance liquid chromatography

國(guó)家科技部國(guó)際合作項(xiàng)目(2011DF31950)

沈肖晶(1990-)，女，碩士研究生

金傳山，jcs4@sohu.com

R284

A

10.3969/j.issn.2095-7246.2014.06.022

2014-09-02)