不同產(chǎn)地大血藤藥材指紋圖譜研究及紅景天苷和綠原酸的含量測(cè)定

李宛蓉 ，桂雙英，2，3 ，王舉濤 ，陶曜天 ，施伶俐

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中藥制劑工程技術(shù)研究中心，安徽 合肥 230012；3.安徽省“115”新安醫(yī)藥研究與開(kāi)發(fā)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，安徽 合肥 230012)

不同產(chǎn)地大血藤藥材指紋圖譜研究及紅景天苷和綠原酸的含量測(cè)定

李宛蓉1，桂雙英1，2，3，王舉濤1，陶曜天1，施伶俐1

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中藥制劑工程技術(shù)研究中心，安徽 合肥 230012；3.安徽省“115”新安醫(yī)藥研究與開(kāi)發(fā)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，安徽 合肥 230012)

目的建立不同產(chǎn)地大血藤藥材的高效液相色譜指紋圖譜，同時(shí)測(cè)定紅景天苷和綠原酸2種成分的含量。方法采用高效液相色譜法，色譜柱為Phenomenex-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈-0.05%磷酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：15 μL；柱溫：30 ℃。結(jié)果10個(gè)產(chǎn)地的大血藤藥材指紋圖譜相似度達(dá)0.9以上，共標(biāo)定14個(gè)共有峰，可確認(rèn)紅景天苷和綠原酸兩個(gè)峰。紅景天苷和綠原酸含量在不同產(chǎn)地大血藤中差異很大，以安徽產(chǎn)大血藤藥材中含量為最高。結(jié)論所建立的高效液相色譜指紋圖譜測(cè)定方法準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好，可作為大血藤藥材的鑒別和內(nèi)在質(zhì)量評(píng)價(jià)的依據(jù)。

大血藤；指紋圖譜；紅景天苷；綠原酸；高效液相色譜法

大血藤又名紅藤、血藤，為木通科植物大血藤Sargentodoxacuneata(Oliv.) Rehd. Et Wils的干燥藤莖，歸大腸、肝經(jīng)，具有清熱解毒、活血、袪風(fēng)止痛之功效[1]。大血藤作為一種傳統(tǒng)中藥，為第三紀(jì)古熱帶植物區(qū)系的孑遺植物，目前主要分布在江西、湖北、四川、云南、安徽等地。大血藤中主要含有蒽醌類、黃酮類、酚類、揮發(fā)油類化合物等[2-4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，大血藤具有抗炎、抗癌、止痛、抗輻射、抗菌及心血管系統(tǒng)活性等作用[5-7]。臨床多以其復(fù)方用于治療慢性盆腔炎、腸癰腹痛、風(fēng)濕痹痛、跌打撲痛、闌尾炎等[8]。目前，《中華人民共和國(guó)藥典》尚無(wú)大血藤成分含量測(cè)定的記載。因此，對(duì)大血藤藥材進(jìn)行鑒別與測(cè)定，進(jìn)一步完善大血藤藥材質(zhì)量控制方法尤為重要。中藥指紋圖譜能比較全面地反映中藥所含化學(xué)成分，本研究采用高效液相色譜法，以紅景天苷、綠原酸為指標(biāo)性成分，對(duì)不同產(chǎn)地大血藤藥材進(jìn)行指紋圖譜研究，并對(duì)其成分進(jìn)行含量測(cè)定，以期為大血藤藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)及其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 Agilent 1260高效液相色譜儀：包括在線真空脫氣機(jī)、四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器；萬(wàn)分之一分析天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；KQ2200型超聲波清洗器：江蘇省昆山市儀器有限公司。乙腈、甲醇均為色譜純；水為超純水，使用前經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò)；其他試劑均為分析純。

1.2 對(duì)照品與樣品 紅景天苷：成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào) MUST-12102401；綠原酸：中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110753-200413；不同產(chǎn)地大血藤藥材樣品來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 大血藤藥材來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Phenomenex-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙睛-0.05%磷酸水，梯度洗脫條件見(jiàn)表2；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量：15 μL；柱溫：30 ℃。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精確稱取紅景天苷對(duì)照品、綠原酸對(duì)照品適量，加甲醇配成含紅景天苷和綠原酸分別為0.160、0.189 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備 稱取樣品粉末(過(guò)60目篩)0.5 g，精密稱定，置50 mL具塞三角燒瓶中，精密加入25 mL甲醇，超聲30 min，冷卻過(guò)濾，補(bǔ)質(zhì)量，取續(xù)濾液20 mL至50 mL容量瓶中，定容，制得供試品溶液。

2.4 指紋圖譜研究

2.4.1 精密度試驗(yàn)：取S1號(hào)大血藤樣品，精密稱定，按照“2.2”項(xiàng)下方法操作，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得共有峰面積的RSD為2.01%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取S1號(hào)大血藤樣品，精密稱定，按照“2.2”項(xiàng)下樣品制備方法操作，分別在0、3、6、9、12 h進(jìn)樣，測(cè)得各共有峰相對(duì)峰面積的RSD為2.47%，表明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取S1號(hào)大血藤樣品6份，按照“2.2”項(xiàng)下樣品制備方法操作，分別測(cè)得各共有峰面積的RSD為2.19%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 大血藤共有指紋峰的建立：獲得10批不同產(chǎn)地大血藤樣品的高效液相色譜圖，采用國(guó)家藥典委員會(huì)開(kāi)發(fā)的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》2004A版相似度軟件進(jìn)行處理，得到10批大血藤樣品的高效液相色譜指紋圖譜的疊加圖(見(jiàn)圖1)。以S1為參照?qǐng)D譜，經(jīng)過(guò)多點(diǎn)校正，自動(dòng)匹配，以平均數(shù)法，生成對(duì)照?qǐng)D譜R，由匹配數(shù)據(jù)的輸出結(jié)果得到共有峰14個(gè)。經(jīng)過(guò)與對(duì)照品的紫外圖譜及保留時(shí)間的比較，確認(rèn)6號(hào)峰為紅景天苷，7號(hào)峰為綠原酸。由于6號(hào)峰峰面積適中，且分離度與峰形較好，因此選作參照色譜峰。設(shè)其保留時(shí)間和峰面積分別為1，其他各共有峰的保留時(shí)間和峰面積分別與參照峰的保留時(shí)間和峰面積相比，計(jì)算各樣品指紋圖譜中共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果分別見(jiàn)表3、表4，并且建立大血藤的高效液相色譜指紋圖譜共有模式，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 10批不同產(chǎn)地大血藤藥材的高效液相色譜疊加圖

圖2不同產(chǎn)地大血藤的高效液相色譜指紋圖譜共有模式

表3 不同產(chǎn)地大血藤藥材指紋圖譜各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

表4 不同產(chǎn)地大血藤藥材指紋圖譜各共有峰的相對(duì)峰面積

2.4.5 不同產(chǎn)地大血藤藥材的相似度比較：將10批不同產(chǎn)地大血藤樣品的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》2004A版相似度軟件，考察色譜峰相似度的一致性，進(jìn)行相似度的評(píng)價(jià)。結(jié)果10批不同產(chǎn)地大血藤樣品圖譜相對(duì)于對(duì)照指紋圖譜的相似度分別為0.989、0.959、0.994、0.991、0.987、0.990、0.987、0.986、0.996、0.969。

2.4.6 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)：對(duì)10批樣品的指紋圖譜分析結(jié)果表明，產(chǎn)地不同的大血藤高效液相色譜指紋圖譜各共有峰相似度很高，相似度范圍為0.959～0.996。表4表明，10批樣品的色譜圖中，峰面積最大的色譜峰均為7號(hào)峰綠原酸，其次為3號(hào)峰。而S10、S6、S9的綠原酸相對(duì)峰面積分別達(dá)到19.079、12.261、8.255，是其他各批次綠原酸均值(4.236 4)的4.5倍，2.89倍和1.95倍。同時(shí)S6、S9、S10三批樣品的各峰相對(duì)峰面積明顯高于其他批次。結(jié)果表明，10批不同產(chǎn)地大血藤的化學(xué)成分相似，但各化學(xué)成分含量有一定的差異。

2.5 含量測(cè)定

2.5.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，以紅景天苷峰計(jì)算理論塔板數(shù)大于3 000，分離度大于1.5。對(duì)照品溶液及供試品溶液的色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3對(duì)照品溶液(A)與供試品溶液(B)的高效液相色譜圖(1.紅景天苷；2.綠原酸)

2.5.2 線性關(guān)系考察：分別精密吸取上述混合對(duì)照品溶液1、2、5、8、12、15 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到紅景天苷回歸方程y=612.51x+35.61，r=0.999 2，綠原酸回歸方程y=1 556.2x，r=0.999 1。紅景天苷、綠原酸進(jìn)樣量分別在0.160～2.400、0.189～2.835 μg時(shí)與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.5.3 精密度試驗(yàn)：精密吸取S1大血藤供試品溶液15 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果表明，紅景天苷和綠原酸峰面積的RSD分別為1.9%、2.2%。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取S1號(hào)大血藤樣品6份，按照“2.2”項(xiàng)下樣品制備方法制樣，各取15 μL進(jìn)樣，結(jié)果紅景天苷與綠原酸含量的RSD分別為1.8%、1.9%。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取S1號(hào)大血藤樣品，精密稱定，按照“2.2”項(xiàng)下方法操作，分別在0、3、6、9、12 h進(jìn)樣，測(cè)得紅景天苷與綠原酸峰面積RSD分別為2.5%和2.1%，表明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.6 回收率試驗(yàn)：精密稱取已知含量的S1大血藤樣品6份，分別精密加入一定量的紅景天苷與綠原酸對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液。依法測(cè)定，結(jié)果紅景天苷與綠原酸的平均回收率分別為98.4%、98.1%，RSD分別為2.3%、2.6%。

2.5.7 含量測(cè)定：分別精密吸取各批藥材的供試品溶液15 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算紅景天苷與綠原酸的含量，見(jiàn)表5。

表5 不同產(chǎn)地大血藤藥材中紅景天苷和綠原酸含量

3 討論

3.1 超聲時(shí)間的考察 對(duì)S6大血藤樣品不同超聲時(shí)間的高效液相色譜圖譜進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)超聲15 min樣品成分溶出不完全；而超聲45 min樣品中較多低含量成分溶出，影響高效液相色譜圖譜各峰分離度；30 min樣品成分溶出較完全且分離度較好。因此，本實(shí)驗(yàn)樣品溶解的超聲時(shí)間確定為30 min。

3.2 流動(dòng)相的考察 流動(dòng)相條件優(yōu)化時(shí)試驗(yàn)了4種流動(dòng)相系統(tǒng)：甲醇-水﹑乙腈-水﹑乙腈-0.05%磷酸水和乙腈-0.01%磷酸水，并嘗試這4種流動(dòng)相系統(tǒng)的多種梯度洗脫程序。結(jié)果顯示，以甲醇-水線性梯度洗脫時(shí)，基線不穩(wěn)，且各色譜峰分離效果不好；采用乙腈-水、乙腈-0.01%磷酸水線性梯度洗脫時(shí)，色譜峰分離效果不理想；而采用乙腈-0.05%磷酸水線性梯度洗脫時(shí)，各色譜峰分離度和峰形都較好，且分離峰數(shù)多，分離效果好。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的考察 本研究采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)190～400 nm掃描的各波長(zhǎng)下的色譜圖進(jìn)行分析比較，結(jié)果顯示280 nm波長(zhǎng)下的色譜圖色譜峰形和分離度較好，色譜信息較豐富，因此選擇280 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4 流速的考察 本研究分別比較流速在0.8、1.0、1.2 mL/min的色譜圖，結(jié)果流速為0.8、1.0 mL/min時(shí)圖譜分離度較好，但0.8 mL/min圖譜分析時(shí)間較長(zhǎng)，1.2 mL/min圖譜分離度不佳。結(jié)果表明，流速在1.0 mL/min時(shí)分離效果較好。

4 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)建立大血藤藥材的高效液相色譜指紋圖譜，并對(duì)紅景天苷和綠原酸進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果表明，產(chǎn)地不同的大血藤高效液相色譜指紋圖譜各共有峰相似度很高，但各成分含量差別很大，以S8安徽產(chǎn)大血藤藥材的紅景天苷與綠原酸含量最高。該方法具有很好的穩(wěn)定性、重復(fù)性和可行性，為大血藤藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)及質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)，對(duì)保證大血藤藥材及其制劑的臨床療效具有重要意義。

本課題組前期研究[9-10]建立了大血藤中紅景天苷的含量測(cè)定方法，并采用正交試驗(yàn)優(yōu)選了大血藤的最佳提取工藝，后期研究表明大血藤水提部位和正丁醇萃取部位對(duì)盆腔炎有一定的治療作用。據(jù)文獻(xiàn)[11-12]報(bào)道，大血藤中大黃素、β-谷甾醇和綠原酸等均具有較強(qiáng)的抗菌活性。綠原酸是一種重要的生物活性物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、升高白細(xì)胞、保肝利膽和興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用[13]。本研究標(biāo)定了大血藤指紋圖譜中6號(hào)峰為紅景天苷，7號(hào)峰為綠原酸，并對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，14個(gè)共有峰中綠原酸含量最高。因此，綠原酸極有可能是大血藤主要抗炎活性物質(zhì)之一。深入明確大血藤抗炎活性化合物或化合物群，指認(rèn)圖譜中各指紋峰的歸屬并對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，有針對(duì)性地對(duì)指紋圖譜的研究方法進(jìn)行優(yōu)化，是今后有待解決的問(wèn)題。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:19.

[2]田瑛,張慧娟,屠愛(ài)萍,等.中藥大血藤的酚性化合物[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2005,40(7):628-631.

[3]高玉瓊,趙德剛,劉建華,等.大血藤揮發(fā)性成分研究[J].中成藥,2004,26(10):843-845.

[4]葛明菊,金則新,李鈞敏,等.大血藤黃酮類化合物組成的初步研究[J].浙江林學(xué)院學(xué)報(bào),2002,19(4):382-386.

[5]李鈞敏,金則新,陳彤,等.紅藤飲片提取物抑菌活性與次生代謝產(chǎn)物含量的相關(guān)性[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2006,35(3):273-280.

[6]王宇歆,李惠芬,周靜,等.大血藤有效部位含量測(cè)定及對(duì)腹腔感染細(xì)菌的抑制活性的研究[J].中成藥,2008,30(8):1230-1232.

[7]馮改利,宋小妹,鄧翀,等.DPPH法篩選大血藤抗氧化活性有效部位[J].陜西中醫(yī),2011,32(9): 1233-1235.

[8]倪士峰,傅承新,吳平.大血藤化學(xué)成分及藥學(xué)研究進(jìn)展[J].中國(guó)野生植物資源,2004,23(4): 8-10.

[9]施伶俐,桂雙英,周金鳳.HPLC法測(cè)定大血藤中紅景天苷的含量[J].安徽醫(yī)藥,2011,15(4):441-442.

[10]陶曜天,施伶俐,儲(chǔ)曉琴,等.正交試驗(yàn)法優(yōu)選大血藤提取工藝[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2012,31(1):71-73.

[11]毛水春,崔承彬,顧謙群.中藥大血藤化學(xué)成分和藥理活性的研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2003,15(6):559-562.

[12]馬瑞麗,于小鳳,徐秀泉,等.大血藤的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)野生植物資源,2012,31(6):1-5.

[13]趙金娟,戴雪梅,曲永勝,等.綠原酸藥效學(xué)研究進(jìn)展[J].中國(guó)野生植物資源,2013,32(4):1-5.

StudyonFingerprintofSargentodoxacuneatafromDifferentHabitatsandDeterminationofSalidrosideandChlorogenicAcidasTwoComponents

LIWan-rong1,GUIShuang-ying1,2,3,WANGJu-tao1,TAOYao-tian1,SHILing-li1

(1.SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 2.AnhuiEngineeringResearchCenterforChineseMedicinePreparation,AnhuiHefei230012,China; 3.Anhui"115"Xin’anTraditionalChineseMedicineResearch&DevelopmentInnovationTeam,AnhuiHefei230012,China)

ObjectiveTo establish the high-performance liquid chromatography (HPLC) fingerprint ofSargentodoxacuneatafrom different habitats and to determine the content of salidroside and chlorogenic acid as two components inSargentodoxacuneata.MethodsHPLC was performed on a Phenomenex-C18column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) with a mobile phase of acetonitrile-0.05% phosphoric acid for gradient elution at a detection wavelength of 280 nm, a flow rate of 1.0 mL/min, a sample size of 15 μL, and a column temperature of 30 ℃.ResultsSargentodoxacuneatafrom 10 habitats had a fingerprint similarity above 0.9; there were 14 common peaks, and the peaks of salidroside and chlorogenic acid were identified. The content of salidroside and chlorogenic acid varied significantly betweenSargentodoxacuneatafrom different habitats, highest inSargentodoxacuneatafrom Anhui Province.ConclusionThe established HPLC fingerprint is accurate, reliable, and reproducible and can be used as a basis for the identification and inherent quality evaluation ofSargentodoxacuneata.

Sargentodoxacuneata;fingerprint; salidroside; chlorogenic acid; high-performance liquid chromatography

安徽省科技攻關(guān)項(xiàng)目(12010402094)；安徽省高等學(xué)校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目(KJ2013Z181)；康緣中醫(yī)藥科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目(KYCX201004)

李宛容(1990-)，女，碩士研究生

桂雙英，guishy0520@126.com

R284.1

A

10.3969/j.issn.2095-7246.2014.06.025

2014-6-20)