肺鱗癌腫瘤浸潤前沿細(xì)胞的EMT表型特點(diǎn)及臨床意義

宋英華 張才擎 曹智新 徐嘉雯 王令成 林曉燕

肺鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell cancer, SCC）是非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的主要病理組織學(xué)類型之一，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐年升高趨勢。雖然早期肺SCC可以治愈，但進(jìn)展期患者的預(yù)后仍較差，局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是其主要原因。因此，尋找可靠的預(yù)測復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)記物對于改善肺SCC的預(yù)后意義重大[1]。

腫瘤浸潤前沿（invasive tumor front, ITF）定義為位于腫瘤與宿主組織和器官交界處的3層-6層細(xì)胞或散在浸潤的細(xì)胞團(tuán)。研究[2]證實，ITF細(xì)胞與腫瘤中心部分細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)迥異，對判斷腫瘤患者預(yù)后具有較高的參考價值。近年來研究發(fā)現(xiàn)，ITF細(xì)胞是發(fā)生上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchaymal transition, EMT）最為明顯的細(xì)胞，其特點(diǎn)是腫瘤細(xì)胞失去上皮細(xì)胞表型（E-cadherin），或者是獲得了間葉細(xì)胞表型（vimentin），從而浸潤性增強(qiáng)并促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展。其中，E-cadherin/β-catenin復(fù)合體在調(diào)控腫瘤的EMT過程中參與了多種人類實體瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移過程，但在ITF細(xì)胞中的表達(dá)意義報道不多[3-5]。本研究旨在探討E-cadherin/β-catinin復(fù)合體和vimentin在肺SCC ITF細(xì)胞中的表達(dá)，分析ITF細(xì)胞的EMT表型與臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系以及在預(yù)測SCC患者預(yù)后中的價值。

1 對象與方法

1.1 組織學(xué)標(biāo)本 收集2011年1月-2012年12月間山東省立醫(yī)院胸外科手術(shù)切除的肺SCC標(biāo)本104例，采集患者完整的臨床病理學(xué)資料。由兩名病理學(xué)醫(yī)生依據(jù)WHO（2004年）標(biāo)準(zhǔn)對HE切片進(jìn)行復(fù)審組織學(xué)診斷。所有患者均進(jìn)行了腫瘤切除以及肺門淋巴結(jié)清掃術(shù)，并在術(shù)前未進(jìn)行放化療。相關(guān)臨床病理資料見表1。

1.2 組織病理學(xué)評估 根據(jù)分化程度將肺SCC分為高分化、中分化和低分化3組。根據(jù)TNM分期分為I期、II期、III期和IV期。腫瘤的浸潤方式通過正常組織-腫瘤組織交界處評價，根據(jù)Bryne's分類，浸潤方式分為4型：1型為推擠型；2型為腫瘤為指狀浸潤或分離的大腫瘤細(xì)胞島；3型為浸潤的腫瘤島由大于15個細(xì)胞組成；4型為浸潤腫瘤細(xì)胞島小于15個細(xì)胞，包括條索樣和單個細(xì)胞浸潤[6]。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 采用SP法，組織切片經(jīng)脫蠟及梯度酒精水化，3%過氧化氫H2O2封閉內(nèi)源性的過氧化物酶，0.01 M枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）微波加熱進(jìn)行抗原修復(fù)。加入一抗室溫孵育60 min，山羊抗鼠二抗室溫孵育30 min?？贵w為E-cadherin單克隆抗體、β-catenin單克隆抗體和vimentin多克隆抗體（北京中杉生物技術(shù)公司）。切片PBS沖洗3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。免疫反應(yīng)結(jié)果經(jīng)2名病理學(xué)醫(yī)師在未知臨床數(shù)據(jù)的情況下分別進(jìn)行判斷。癌旁肺組織做為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 染色結(jié)果判斷 選擇典型的陽性染色區(qū)域，高倍鏡下觀察5個視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，總共計數(shù)500個細(xì)胞，然后計算出陽性百分率。根據(jù)染色強(qiáng)度和分布進(jìn)行半定量評分：免疫組化分?jǐn)?shù)=染色強(qiáng)度得分×陽性率得分。染色強(qiáng)度分為：陰性為0分，弱陽性1分，中等陽性2分和強(qiáng)陽性3分。陽性細(xì)胞比率分為：陰性為0分，＜10%為1分，11%-50%為2分，51%-80%為3分，≥81%為4分。根據(jù)最終得分將染色結(jié)果分為：陰性，為0分；1分-4分為低表達(dá)，≥4分為高表達(dá)。腫瘤浸潤前沿細(xì)胞的免疫組化染色結(jié)果判斷也按照此標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[7]。

1.5 隨訪和統(tǒng)計學(xué)分析 104例患者的隨訪時間為52周-144周，中位隨訪時間為106周。總生存率和無病生存率應(yīng)用Kaplan-Meier曲線計算，用Log-rank檢驗對照。采用單因素和多因素Cox比例回歸模型分析預(yù)后因素。臨床病理學(xué)參數(shù)和E-cadherin、β-catenin和vimentin的表達(dá)關(guān)系應(yīng)用χ2檢驗。數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 16.0 for windows統(tǒng)計分析軟件。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EMT蛋白在肺SCC ITF細(xì)胞中的表達(dá) E-cadherin在正常肺泡上皮呈胞膜強(qiáng)陽性表達(dá)，在SCC中心部分腫瘤細(xì)胞表達(dá)降低或缺失（33.0%, 34/104），在ITF細(xì)胞中表達(dá)缺失率（53.8%, 56/104），較前兩者明顯降低（P＜0.05）。β-catenin在正常肺泡上皮呈胞膜陽性，中心腫瘤組織陽性率為84.6%（88/104），而ITF細(xì)胞的陽性率為67.3%（70/104），較正常組織和非ITF細(xì)胞均明顯降低（P=0.01），部分細(xì)胞還出現(xiàn)了胞質(zhì)和細(xì)胞核表達(dá)（20.0%，21/104）。Vimentin在正常肺組織上皮細(xì)胞不表達(dá)，但在23.1%（24/104）的SCC非ITF 細(xì)胞的腫瘤組織強(qiáng)弱不等的陽性表達(dá)，而在ITF的細(xì)胞陽性率明顯增加（42.3%，44/104高表達(dá)）（P=0.008）（圖1，表1）。

表1 E-cadherin、β-catenin和vimentin在肺SCC腫瘤中央細(xì)胞及ITF細(xì)胞的表達(dá)Tab 1 Comparetion between E-cadherin, β-catenin and vimentin expression of ITF cells and tumor central cells

2.2 SCC ITF細(xì)胞中E-cadherin、β-catenin 和vimentin表達(dá)與各臨床病理特征的關(guān)系 E-cadherin、β-catenin和vimentin在SCC ITF細(xì)胞的表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、組織學(xué)分化程度和臨床分期均無相關(guān)性。ITF細(xì)胞中E-cadherin低表達(dá)和vimentin高表達(dá)在3型、4型浸潤方式的ITF細(xì)胞中更為明顯（P分別為0.01和0.02）。β-catenin在ITF細(xì)胞的表達(dá)與浸潤方式無關(guān)，但是在3型、4型浸潤方式中出現(xiàn)細(xì)胞核/質(zhì)異常染色的比率（27.9%, 17/61）明顯高于1型、2型浸潤方式（15%, 6/40）（P=0.04）。此外，三者在ITF細(xì)胞中的表達(dá)均與肺門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)。ITF細(xì)胞中E-cadherin下調(diào)組，β-catenin下調(diào)組和Vimentin上調(diào)組出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率與對照組相比（66.1%vs 45.8%； 73.5% vs 48.6%； 70.0% vs 48.4%），具有明顯差異（P分別為0.04、0.02和0.03）。ITF細(xì)胞中E-cadherin低表達(dá)組，β-catenin低表達(dá)組和vimentin高表達(dá)組出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)率與對照組相比（35.7% vs 18.8%； 41.2% vs 21.4%； 42.5%vs 18.8%），差異明顯（P分別為0.04、0.04和0.01）。分析三者間的表達(dá)關(guān)系顯示，E-cadherin的表達(dá)與β-catenin正相關(guān)（P=0.01），與vimentin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P=0.035）；而vimentin和β-catenin兩者的表達(dá)不相關(guān)（表2）。

2.3 生存分析 根據(jù)最后一次隨訪的結(jié)果，24例（23.1%）患者無瘤存活，20例（19.2%）患者帶瘤生存，60例患者（57.7%）死于腫瘤復(fù)發(fā)。Kaplan-Meier法分析顯示ITF E-cadherin高表達(dá)組和vimentin低表達(dá)組的患者預(yù)后分別較ITF E-cadherin低表達(dá)組和vimentin高表達(dá)組好（P＜0.01）（圖2）。根據(jù)單因素的Cox比例風(fēng)險回歸模型分析，腫瘤大?。≒=0.04）、淋巴結(jié)狀態(tài)（P=0.04）、ITF細(xì)胞的vimentin（P＜0.01）和E-cadherin的表達(dá)水平（P＜0.01）與總生存率相關(guān)。在多因素Cox比例回歸分析，ITF細(xì)胞的vimentin表達(dá)（P=0.042）和E-cadherin表達(dá)（P=0.016）與患者的總生存率和無病生存密切相關(guān)。

圖1 EMT相關(guān)蛋白在肺SCC中的表達(dá)。E-cadherin在肺SCC組織中的表達(dá)情況（A），在中央腫瘤組織胞膜強(qiáng)陽性（B），而ITF細(xì)胞中為陰性（C）；β-catenin在肺SCC組織中的表達(dá)情況（D），顯示在腫瘤中央細(xì)胞胞膜和胞漿陽性（E），而ITF組織中為陰性（F）；vimentin在肺SCC組織中的表達(dá)（G），顯示腫瘤中央細(xì)胞為陰性表達(dá)（H），而在ITF組織中高表達(dá)（I）（HE染色，A、D和G ×100倍；B、C、E、F、H、I×400倍）。Fig 1 EMT protein expression was examined by immunohistochemistry in lung SCC. Expression of E-cadherin in lung SCC (A): E-cadherin was strong positive membranous staining (B), but negative was found in ITF cells (C)； Expression of β-catenin in lung SCC (D), β-catenin was membranous or cytoplasmic positive staining (E), but negative in ITF cells (F)； Expression of vimentin in lung SCC (G): vimentin was cytoplasmic positive staining (H), but negative in ITF cells (I). (A, D, H, ×100； B, C, E, F, H, I, ×400). EMT: epithelial-mesenchymal transition.

3 討論

所謂ITF是指位于腫瘤與宿主組織或器官交界處最前沿的3層-6層腫瘤細(xì)胞或分散的細(xì)胞團(tuán)，該部分腫瘤細(xì)胞較之其他部分腫瘤細(xì)胞分化更差，其形態(tài)和功能特征更能反映腫瘤的生物多形性及侵襲性，眾多研究發(fā)現(xiàn)多種腫瘤的預(yù)后與ITF細(xì)胞的生物學(xué)特性密切相關(guān)。

E-cadherin是上皮細(xì)胞中表達(dá)的一種鈣依賴性跨膜糖蛋白。正常情況下E-cadherin的胞質(zhì)內(nèi)區(qū)段與β-catenin形成復(fù)合體，作為細(xì)胞-細(xì)胞連接促進(jìn)細(xì)胞間的粘附性，在維持細(xì)胞極性和組織學(xué)結(jié)構(gòu)中發(fā)揮重要作用。已證實多種惡性上皮性腫瘤中E-cadherin/β-catenin復(fù)合體表達(dá)下調(diào)與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后有關(guān)[3-5]，但有關(guān)肺SCC ITF細(xì)胞的研究少見。本研究結(jié)果顯示E-cadherin在肺SCC腫瘤組織尤其是在ITF細(xì)胞中表達(dá)較正常組織降低，并與腫瘤的浸潤方式、肺門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等因素密切相關(guān)，單因素及多因素分析均顯示其是肺SCC的預(yù)后標(biāo)記。這與Choi等[8]的研究結(jié)果一致。有關(guān)SCC ITF細(xì)胞EMT表型的研究目前多見于口腔SSC腫瘤中，Kim等[9]檢測到83例口腔SCC ITF細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)降低并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后有關(guān)。而Wang等[10]研究認(rèn)為E-cadherin在肺 SCC ITF細(xì)胞的表達(dá)缺失并不是無瘤生存期的預(yù)后指標(biāo)。

表2 E-cadherin、β-catenin和vimentin三者在SCC ITF細(xì)胞的表達(dá)與各種臨床病理特征的關(guān)系Tab 2 Relationship between E-cadherin, β-catenin and vimentin expression levels of ITF cells and clinical variables of SCC

圖2 ITF細(xì)胞中EMT表型與患者預(yù)后的關(guān)系。A：E-cadherin；B：vimentin。Fig 2 Survival curve by expression of E-cadherin and vimentin in lung SCC. A: E-cadherin；B: vimentin.

β-catenin是一種雙向功能的連接素，正常位于胞膜。在致癌因子的作用下β-catenin聚集于細(xì)胞質(zhì)和/或胞核中，與TCF/LEF（T cell factor/lymphoid enhancer factor）結(jié)合啟動cyclin D1和c-myc等基因轉(zhuǎn)錄，加快腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[11]。β-catenin在肺癌ITF中的表達(dá)鮮見報道。本研究證實肺SCC的ITF細(xì)胞中β-catenin表達(dá)明顯低于正常組織和非ITF腫瘤中心組織，同時觀察到出現(xiàn)胞核異常表達(dá)，并且與肺門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)。Choi等[8]研究也認(rèn)為β-catenin的表達(dá)缺失與肺腺癌的預(yù)后相關(guān)，而與SCC的預(yù)后無關(guān)。Sasaya等[12]研究了62例口腔SCC中β-catenin的表達(dá)，顯示ITF細(xì)胞β-catenin表達(dá)降低出現(xiàn)胞質(zhì)/胞核著色，并與不良預(yù)后有關(guān)。Zhang等[13-15]認(rèn)為腫瘤組織β-catenin的表達(dá)缺失與肺癌患者無病生存期有關(guān)，而我們的研究中發(fā)現(xiàn)兩者并無相關(guān)性，分析原因可能與樣本數(shù)量和判斷標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)。目前，有關(guān)β-catenin表達(dá)及預(yù)后意義的研究結(jié)論還有待大樣本深入研究[16,17]。

Vimentin是一種間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，其表達(dá)與多種惡性腫瘤如乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌和前列腺癌的惡性表型和不良預(yù)后相關(guān)[18]。Soltermann等[19]發(fā)現(xiàn)vimentin的啟動子是β-catenin/TCF細(xì)胞通路的靶點(diǎn)，共同參與了細(xì)胞侵襲和遷移。本文研究結(jié)果表明vimentin在肺SCC的ITF細(xì)胞表達(dá)較非ITF細(xì)胞明顯增加，vimentin強(qiáng)陽性表達(dá)在腫瘤的ITF細(xì)胞中是常見的現(xiàn)象，并與腫瘤的浸潤方式、肺門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤復(fù)發(fā)密切相關(guān)。我們應(yīng)用單因素或多因素分析顯示，vimentin的過表達(dá)與短的總生存時間和無病生存時間有關(guān)，提示腫瘤ITF細(xì)胞vimentin高表達(dá)是提示不良預(yù)后的分子標(biāo)志物之一。

通過分析E-cadherin/cantenin和vimentin三者的表達(dá)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在腫瘤的ITF細(xì)胞E-cadherin和β-catenin的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系；vimentin和E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，vimentin表達(dá)與E-cadherin丟失是細(xì)胞間葉化的特征，這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步支持了vimentin可下調(diào)E-cadherin表達(dá)的結(jié)論[20]。然而vimentin表達(dá)與β-catenin無關(guān)，提示可能是β-catenin/TCF通路可能在調(diào)控vimentin表達(dá)的過程中未發(fā)揮作用。

總之，E-cadherin/β-catenin與vimentin在肺SCC ITF細(xì)胞中的表達(dá)與患者的預(yù)后密切相關(guān)，這些指標(biāo)的異常表達(dá)可預(yù)測患者的不良預(yù)后，其具體的預(yù)后價值尚需大樣本資料的進(jìn)一步研究。