聚集相關(guān)蛋白基因與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1對(duì)肺癌相關(guān)生物材料表皮葡萄球菌生物膜形成的影響

陳穎 雷玉潔 黃云超 饒鐘鳴 葉聯(lián)華 趙光強(qiáng) 王小燕

在肺癌診療過(guò)程中幾乎每位肺癌患者都可能永久或暫時(shí)被植入生物材料如：血管導(dǎo)管、外科縫合線、支架、引流管等。肺癌患者自身免疫低下，在接受綜合治療如：手術(shù)、化療、放療過(guò)程中又加重了自身的免疫功能損傷，易并發(fā)院內(nèi)感染，特別是以生物材料為中心的感染（biomaterial centered infection, BCI），是院內(nèi)感染的高發(fā)人群。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)由于細(xì)菌粘附于植入材料表面形成生物膜（biofilm, BF）以及機(jī)體免疫功能失調(diào)是造成BCI反復(fù)發(fā)作，難以控制的關(guān)鍵因素[1]。

BCI多由葡萄球菌屬引起，特別是定植皮膚、粘膜表面條件致病菌表皮葡萄球菌（staphylococcus epidermidis, SE）常伴隨植入過(guò)程侵入體內(nèi)[2]。SE粘附于植入材料表面后，其分泌的聚集相關(guān)蛋白（accumulation-associated protein, Aap），可促進(jìn)SE聚集形成BF，是形成細(xì)菌生物膜的主要成分。

轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor β1,TGF-β1）是惡性細(xì)胞分泌的免疫抑制因子之一，是一類功能復(fù)雜的細(xì)胞因子。由肺癌細(xì)胞分泌的TGF-β1不僅與細(xì)胞免疫失調(diào)密切相關(guān)，而且與肺癌的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后關(guān)系密切[3-5]。

本實(shí)驗(yàn)探討TGF-β1與表皮葡萄球菌Aap基因?qū)Ψ伟┗颊哚t(yī)用硅橡膠材料表面生物膜形成的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用菌種及試劑、器材 表皮葡萄球標(biāo)準(zhǔn)株RP62A（生物膜表型陽(yáng)性，經(jīng)基因組測(cè)序證明存在完整Aap基因），ATCC 12228（生物膜表型陰性，經(jīng)基因組測(cè)序證明Aap基因缺失）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549由云南省腫瘤研究所提供；人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（PeproTech公司，美國(guó)）；淋巴細(xì)胞分離液（Sigma公司，美國(guó)）；API試紙條（BioMerirux公司，法國(guó)）； rTaq DNA Marker（Takara公司，日本）；PCR使用所用引物如表1所示，由大連TaKaRa生物工程有限公司設(shè)計(jì)，上海生工生物工程有限公司合成。

醫(yī)用硅橡膠（四川大學(xué)生物材料系），將硅橡膠材料加工成面積0.5 cm×1.0 cm大小，甲醛熏蒸24 h滅菌備用。RPMI 1640培養(yǎng)基、DMSO、PBS緩沖液（GIBCO公司，美國(guó)）；FBS（COSTAR公司，美國(guó)）；電子顯微鏡EYO LS10（Carl Zeiss公司德國(guó)）；紫外分光光度儀、梯度PCR儀（Bio-Rad公司，美國(guó)）。

1.2 臨床表皮葡萄菌的分離、鑒定及細(xì)菌DNA的提取

1.2.1 臨床表皮葡萄菌的分離、鑒定 留置胸腔引流管的肺癌患者，在排除導(dǎo)管部位發(fā)炎或化膿及其他原因的急性發(fā)熱、寒顫等全身情況下，拔除導(dǎo)管。將導(dǎo)管頂端3 cm浸于肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)振蕩、超聲洗脫或離心處理后，使用肉湯進(jìn)行倍比稀釋，種植于血瓊脂平板上。根據(jù)血瓊脂平板上菌落的形態(tài)及革蘭氏染色，API試劑條行種屬鑒定，確認(rèn)所分離到的細(xì)菌為表皮葡萄球菌。

1.2.2 細(xì)菌DNA的提取 選取單個(gè)葡萄球菌接種于5 mL肉湯培養(yǎng)基37oC震蕩過(guò)夜，加入180 μL的TE緩沖液吹勻，加入20 μL 50 mg/mL溶菌酶溶液37oC溫育20 min后，加入15 μL的蛋白酶K混勻，55oC溫育40 min。加入5 μL RNase A震蕩樣品，靜置20 min。加入220 μL BTL緩沖液，混勻后再65oC溫育10 min。將上清轉(zhuǎn)入新管中，500 μL Buffer HB溶液，10,000 g離心1 min。1 mL的70%乙醇洗滌后沉淀，離心棄乙醇，重溶于200 μL TE緩沖液中，準(zhǔn)備PCR檢測(cè)。

表1 PCR引物、復(fù)性溫度及產(chǎn)物長(zhǎng)度Tab 1 The PCR primers, annealing temperature and the products lengths

1.2.3 PCR擴(kuò)增Aap DNA、16s rRNA，檢測(cè)臨床表皮葡萄球菌株Aap基因 以表皮葡萄球菌基因組為模板，16s rRNA為內(nèi)參，擴(kuò)增Aap基因（表1）。PCR反應(yīng)過(guò)程：起始變性: 94oC 3 min；變性: 94oC 30 s；退火（Aap）：58oC 30 s，退火（16s rRNA）: 60oC 30 s；延伸: 72oC 1 min；循環(huán): 第2-4步驟35個(gè)循環(huán)；最終延伸: 72oC 10 min。微量加樣槍取DNA 2 μL加入的2%瓊脂糖凝膠板，加入Marker 2 μL，在電泳槽內(nèi)進(jìn)行100 V電泳20 min，成像儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)臨床SE分離株Aap基因表達(dá)。

1.3 表皮葡萄球菌Aap基因在醫(yī)用硅橡膠上生物膜形成情況 將臨床分離SE Aap+株38株，SE Aap-株8株，濃度調(diào)整為1×106/mL，與醫(yī)用硅橡膠在24孔板內(nèi)培養(yǎng)30 h，取出硅橡膠材料。PBS液進(jìn)行沖洗3遍，Bouin固定液進(jìn)行固定1 h，無(wú)菌蒸餾水沖洗3遍。使用結(jié)晶紫染色3 min，再次無(wú)菌蒸餾水沖洗，晾干在微量酶測(cè)量標(biāo)儀上測(cè)定490 nm波長(zhǎng)吸光度值，測(cè)定每株細(xì)菌均值。按上述方法測(cè)出空白對(duì)照490 nm的均值。用實(shí)驗(yàn)組值減去空白對(duì)照組值，差值＞0.12的菌株即可判斷細(xì)菌生物膜形成。

1.4 非小細(xì)胞肺患者PBMCs分離及A549制備 采集非小細(xì)胞肺癌患者外周靜脈血10 mL，使用淋巴細(xì)胞分離液，在2,000 r/min，溫度4oC下離心20 min。小心吸出血漿層和淋巴細(xì)胞分離液交界的外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）。轉(zhuǎn)移入另一15 mL離心管中加入Hanks液1,000 r/min離心10 min后洗滌3次，使用含10%PBS的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)液，置于37oC、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)備用。

復(fù)蘇A549細(xì)胞株，用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，在37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2天后細(xì)胞傳代，加入0.25%胰酶消化，取第3代生長(zhǎng)旺盛細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為1×106/mL。

1.5 不同濃度TGF-β1下醫(yī)用硅橡膠表面生物膜的形成選取SE Aap+株、SE Aap-株（各6株）以及SE標(biāo)準(zhǔn)株，RP62A、ATCC12228濃度為1×106/mL細(xì)菌懸液各1 mL。加入在不同濃度（0 ng/mL, 10 ng/mL, 20 ng/mL, 40 ng/mL）的TGF-β1因子下，在濃度1×106/mL的A549細(xì)胞，濃度為1×106/mL，PBMCs中共培養(yǎng)30 h上清液中1 mL。后與滅菌硅醫(yī)用橡膠（每組兩片）共培養(yǎng)30 h，半定量粘附試驗(yàn)檢測(cè)表皮葡萄球菌細(xì)菌生物膜形成的情況方法同前。

SEM標(biāo)本制作和觀察用羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）緩沖液（pH=7）沖洗3次，4%戊二醛固定于SEM載物臺(tái)上，PBS沖洗3遍，二氧化碳（CO2）臨界干燥，離子濺射表面固定鍍膜致PVC材料表面成金黃色，掃描電鏡觀察細(xì)菌生物膜表面結(jié)構(gòu)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組的細(xì)胞膜生長(zhǎng)情況先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊則采用單因素方差分析進(jìn)行F檢驗(yàn)，進(jìn)一步做兩兩比較使用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 表皮葡萄球菌臨床分離株Aap基因PCR檢測(cè)結(jié)果 臨床表皮葡萄球菌分離株46株與標(biāo)準(zhǔn)株RP62A、ATCC1228株，經(jīng)PCR檢測(cè)：46株表皮葡萄球菌的16s RNA檢測(cè)陽(yáng)性率為100%。Aap+株共38株，陽(yáng)性率82.6%，Aap-株共8株，陰性率17.4%（圖1）。

2.2 表葡菌生物膜的形成能力與Aap基因的相關(guān)分析 半定量作為判定生物膜形成能力的標(biāo)準(zhǔn)，Aap基因的存在與SE生物膜形成密切相關(guān)（P＜0.01）（表2）。

2.3 TGF-β1因子對(duì)SE Aap+株細(xì)菌生物膜形成的影響 半定量方法測(cè)結(jié)果：10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL TGF-β1因子刺激下SE986、SE842、SE317、SE276、RP62A細(xì)菌生物膜的厚度大于空白對(duì)照組（P＜0.05）。通過(guò)組間比較q檢驗(yàn)提示20 ng/mL、40 ng/mL組細(xì)菌生物膜的厚度無(wú)差異（P＞0.05）（表3）。

2.4 TGF-β1因子對(duì)SE Aap-株細(xì)菌生物膜形成的影響 通過(guò)半定量方法測(cè)量結(jié)果：10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL TGF-β1因子刺激下的各表皮葡萄球菌的厚度與空白對(duì)照組未見(jiàn)差異（P＞0.05）。各濃度TGF-β1組間比較未見(jiàn)差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)證明SE Aap-在不同濃度TGF-β1因子刺激（0 ng/mL, 10 ng/mL, 20 ng/mL, 40 ng/mL）均不能形成細(xì)菌生物膜（表4）。

2.5 SEM觀察不同濃度TGF-β1組醫(yī)用硅橡膠表面細(xì)菌生物膜形成情況 SE Aap+株與RP62A株，在（10 ng/mL, 20 ng/mL, 40 ng/mL）TGF-β1組中，可觀察到在醫(yī)用硅橡膠表面大量SE相互聚集重疊，形成生物膜；在對(duì)照組中，僅見(jiàn)少量聚集SE粘附與硅橡膠表面，無(wú)生物膜形成（圖2）。

SE Aap-株與標(biāo)準(zhǔn)株ATCC12228株，在（10 ng/mL, 20 ng/mL, 40 ng/mL）TGF-β1組及在對(duì)照組中，可觀察到在醫(yī)用硅橡膠表面零散分布單個(gè)表皮葡萄球菌，未觀察到表皮葡萄球菌出現(xiàn)相互聚集產(chǎn)生細(xì)菌生物膜（圖3）。

表2 表皮葡萄球菌Aap基因檢測(cè)陽(yáng)性率與生物膜表型檢測(cè)Tab 2 The Staphylococcus epidermidis Aap genetic testing positive rate of biofilm formation detection

表3 不同濃度TGF-β1對(duì)A549上清液與外周單個(gè)核細(xì)胞共同培養(yǎng)下Aap+表葡菌生物膜厚度（Mean±SD）Tab 3 Different concentrations of TGF-β1 on the A549 supernatant and peripheral mononuclear cells co-cultured in the Aap positive SE biofilm thickness (Mean±SD)

表4 不同濃度TGF-β1對(duì)A549上清液與外周單個(gè)核細(xì)胞共同培養(yǎng)下Aap-表葡菌生物膜厚度的作用（Mean±SD）Tab 4 Different concentrations of TGF-β1 on the A549 supernatant and peripheral mononuclear cells co-cultured in the Aap negative SE biofilm thickness (Mean±SD)

圖1 表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果Fig 1 Gel electrophoresis figure of PCR products

圖2 SEM圖片。A：40 ng/mL TGF-β1組SE Aap+株SEM圖片；B: 20 ng/mL TGF-β1組SE Aap+株SEM圖片；C：10 ng/mL TGF-β1組SE Aap+株SEM圖片；D：0 ng/mL TGF-β1組SE Aap+株SEM圖片。Fig 2 SEM pictures. A: The SEM picture of Aap postive SE biofilm in 40 ng/mL TGF-β1 gourp； B: The SEM picture of Aap postive SE biofilm in 20 ng/mL TGF-β1 gourp； C: The SEM picture of Aap postive SE biofilm in 10 ng/mL TGF-β1 gourp； D: The SEM picture of Aap postive SE biofilm in 0 ng/mL TGF-β1 gourp.

圖3 SEM圖片。A：40 ng/mL TGF-β1組SE Aap-株SEM圖片；B：20 ng/mL TGF-β1組SE Aap-株SEM圖片；C：10 ng/mL TGF-β1組SE Aap-株SEM圖片；D：0 ng/mL TGF-β1組SE Aap-株SEM圖片。Fig 3 SEM pictures. A: The SEM picture of Aap negative SE biofilm in 40 ng/mL TGF-β1 group； B: The SEM picture of Aap negative SE biofilm in 20 ng/mL TGF-β1 group； C: The SEM picture of Aap negative SE biofilm in 10 ng/mL TGF-β1 group； D: The SEM picture of Aap negative SE biofilm in 0 ng/mL TGF-β1 group.

3 討論

研究[6,7]表明，肺癌患者的免疫應(yīng)答以T細(xì)胞免疫為主，肺癌細(xì)胞產(chǎn)生的免疫抑制因子TGF-β1是造成癌癥患者免疫功能紊亂、Th1/Th2因子失調(diào)、T淋巴細(xì)胞與NK細(xì)胞活性較低的主要原因之一。肺癌患者接受手術(shù)、化療、放療過(guò)程中，更易受條件致病菌感染。

肺癌治療過(guò)程中所植入的生物材料增加了細(xì)菌入侵宿主途徑，降低了機(jī)體的防御能力，BCI上升明顯。對(duì)于抵抗力較低的癌癥患者來(lái)說(shuō)，一旦發(fā)生BCI，死亡率高達(dá)3%-60%，甚至可達(dá)到80%。研究[8]表明，BCI與細(xì)菌在生物材料表面粘附形成BF密切相關(guān)。在TGF-β1因子高表達(dá)的肺癌患者，中心靜脈導(dǎo)管相關(guān)性血流感染幾率較高，細(xì)菌產(chǎn)生BF的比例也升高。定植皮膚表面的條件致病菌SE是植入材料感染的主要條件致病菌，占肺癌患者BCI的40%。

Aap是一種SE細(xì)胞壁錨定蛋白，在BF形成的初期可促進(jìn)細(xì)菌相互粘附，是SE生物膜的主要成分之一[9]。Aap結(jié)構(gòu)包括A末端區(qū)域和B重復(fù)區(qū)域。A區(qū)域功能在于使SE粘附在人皮膚表面，B區(qū)域可以增強(qiáng)其粘附功能。B重復(fù)區(qū)域由5到17個(gè)可變數(shù)量的幾乎相同128氨基酸組成的保守半重復(fù)末端結(jié)構(gòu)，通過(guò)Zn2+-依賴的D二聚體實(shí)現(xiàn)細(xì)菌間的直接粘附[10,11]。通過(guò)Zn2+螯合劑可以抑制SE Aap基因的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)菌生物膜的形成。Aap基因陰性的表皮葡萄球菌M7株，可以粘附在生物材料表面，但是不能在其表面聚集形成生物膜。

醫(yī)用硅橡膠價(jià)格低廉、易加工、生物相容性良好是臨床中最常用生物材料之一，廣泛用于制作醫(yī)用導(dǎo)管、引流管及假體植入等。研究臨床分離SE Aap+株與SE Aap-株在醫(yī)用硅橡膠生物膜的形成。結(jié)果提示在肺癌患者醫(yī)用硅橡膠引流管植入引起感染中，表皮葡萄球菌Aap基因與細(xì)菌生物膜密切相關(guān)，臨床分離葡萄球菌Aap-株不能在硅橡膠表面形成細(xì)菌生物膜。提示Aap基因是表皮葡萄球菌生物膜形成過(guò)程中的重要調(diào)節(jié)基因，調(diào)控細(xì)菌聚集相關(guān)過(guò)程，缺乏Aap基因所調(diào)控的聚集相關(guān)蛋白的輔助，表皮葡萄球菌難以在生物材料相互聚集形成細(xì)菌群落，最終形成生物膜。

本研究通過(guò)分離肺癌患者外周單個(gè)核細(xì)胞與肺腺癌細(xì)胞A549在不同濃度TGF-β1因子刺激下共同培養(yǎng)，模擬體外肺癌免疫抑制狀態(tài)下表皮葡萄球菌臨床分離株在生物材料表面形成過(guò)程。結(jié)果提示TGF-β1對(duì)在肺癌細(xì)胞微環(huán)境中SE Aap+生物膜形成有一定促進(jìn)作用?？赡苁怯捎诜伟┗颊逿淋巴細(xì)胞與NK細(xì)胞活性以及體內(nèi)非特異性殺傷因子水平較健康人群低下[12]，TGF-β1的加入進(jìn)一步抑制肺癌患者PBMCs相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，導(dǎo)致對(duì)細(xì)菌的殺傷作用下降，細(xì)菌更易達(dá)到粘附在生物材料表面所需數(shù)量。當(dāng)局部粘附的SE數(shù)量達(dá)到一定程度后，由于肺癌患者機(jī)體因子失調(diào)，免疫監(jiān)視紊亂，可能導(dǎo)致細(xì)菌在生物材料上聚集過(guò)程不易引發(fā)免疫細(xì)胞吞噬作用[13,14]。最終導(dǎo)致細(xì)菌之間相互粘附、分化、增殖，并分泌大量細(xì)胞外粘物質(zhì)形成BF。

肺癌患者體內(nèi)免疫因子與TGF-β1作用關(guān)系復(fù)雜，表皮葡萄球菌細(xì)菌生物膜形成的分子學(xué)研究不但涉及蛋白依賴，而且還存在多糖依賴等。生物材料植入感染BF形成與生物材料、病原菌、宿主三者的相互關(guān)系密不可分。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于BCI的研究大多數(shù)集中在心血管、口腔、泌尿、整形骨科等學(xué)科領(lǐng)域，而對(duì)肺癌患者治療中出現(xiàn)的BCI的研究報(bào)道不多，如何分別從生物材料、細(xì)菌基因水平、宿主三個(gè)方面預(yù)防肺癌治療中BCI值得進(jìn)一步研究。