抑癌基因TCF21對(duì)肺癌細(xì)胞A549增殖、凋亡和遷移的影響

胡松 陽(yáng)諾 陳銘伍 郭建極 冼磊

肺癌是臨床常見惡性腫瘤，并且有著最高的癌癥相關(guān)死亡率[1]。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是最常見的肺癌類型，約占到了肺癌的85%[2]。由于75%的肺癌患者在確診時(shí)已經(jīng)有局部或者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此肺癌患者總的5年生存率非常低[3]。對(duì)肺癌發(fā)生的可能分子機(jī)制研究有限，是肺癌早期診斷率低和患者預(yù)后不良的重要原因之一。

抑癌基因的失活會(huì)導(dǎo)致腫瘤的形成和惡性轉(zhuǎn)化。目前，許多研究[4-10]表明，抑癌基因的失活在肺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。轉(zhuǎn)錄因子21（transcription factor 21,TCF21）是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，它在多種腫瘤中因存在啟動(dòng)子區(qū)甲基化，而導(dǎo)致TCF21在癌組織中的表達(dá)較癌旁組織降低[11-13]。前期研究[14]表明TCF21在肺癌中低表達(dá)，這與其啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度升高有關(guān)。而這種表達(dá)降低對(duì)肺癌的發(fā)生發(fā)展有何意義，目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。

慢病毒載體可以整合、攜帶目的基因，并侵染靶細(xì)胞，利用這一技術(shù)可以在靶細(xì)胞中大量表達(dá)目的基因。使用攜帶有綠色熒光蛋白基因的慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可以通過(guò)觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)來(lái)初步判斷慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。基于本課題組前期組織水平的研究結(jié)果，本研究從細(xì)胞水平探索TCF21的生物學(xué)功能。利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)在肺癌細(xì)胞A549中高表達(dá)TCF21，用熒光定量PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)TCF21基因的mRNA和蛋白的表達(dá)水平。在確定高表達(dá)成功后，利用MTT實(shí)驗(yàn)、Transwell、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TCF21過(guò)表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌細(xì)胞A549購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，用含10%胎牛血清，1%的青霉素鏈霉素的1640培養(yǎng)基，于37oC、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.2 慢病毒轉(zhuǎn)染 過(guò)表達(dá)慢病毒載體由Invitrogen公司合成并構(gòu)建。細(xì)胞分為三組：第一組為轉(zhuǎn)染Lenti-TCF21組（過(guò)表達(dá)組），第二組為轉(zhuǎn)染空載體病毒組（空白載體組），第三組為不轉(zhuǎn)染病毒組（未處理組）。轉(zhuǎn)染流程按照Invitrogen公司說(shuō)明書進(jìn)行。于轉(zhuǎn)染前8 h將A549細(xì)胞按3,000個(gè)/孔接種至24孔板，待細(xì)胞融合率達(dá)到30%-50%時(shí)開始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染MOI值為100，總液體量為500 μL/孔。轉(zhuǎn)染10 h后將液體換為含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h共8個(gè)時(shí)點(diǎn)，隨機(jī)選取多個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)白光與熒光條件下的可見細(xì)胞數(shù)，通過(guò)相同視野中熒光條件下可見細(xì)胞數(shù)與白光下可見細(xì)胞數(shù)之比來(lái)計(jì)算平均轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染72 h后熒光最強(qiáng)，于此時(shí)收獲細(xì)胞用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 熒光定量PCR 按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書步驟提取細(xì)胞總RNA。然后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用Roche公司的SYBR Green Master Mix進(jìn)行熒光定量PCR。PCR進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為（94oC 30 s,54.5oC 30 s, 72oC 30 s）。引物如下: TCF21上游20 bp，5'-CC AGCTACATCGCCCACTTG-3'，下游23 bp，5'-CTTTCAGG TCACTCTCGGGTTTC-3'，GAPDH上游20 bp，5'-ACCACA GTCCATGCCATCAC-3'，下游20 bp，5'-TCCACCACCCTG TTGCTGTA-3'。TCF21基因轉(zhuǎn)錄水平按照2-ΔΔCt法通過(guò)管家基因GAPDH進(jìn)行校正。

1.4 Western blot 使用細(xì)胞裂解液從各組細(xì)胞中提取細(xì)胞總蛋白。蛋白樣品用12% SDS-PAGE跑膠后轉(zhuǎn)膜至0.22 μm的PVDF膜上。5%牛奶室溫封閉1 h，4oC孵育TCF21（1:1,000稀釋）和GAPDH（1:5,000稀釋）一抗過(guò)夜。兔抗人多克隆抗TCF21抗體購(gòu)自Abcam公司（Ab32981）。充分洗膜后室溫孵育二抗1 h。再次洗膜后于暗室中顯影、定影。

1.5 MTT 在96孔板中分別轉(zhuǎn)染和處理三組細(xì)胞，分別在轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h、96 h加入20 μL/孔5 mg/mL的MTT溶液；繼續(xù)37oC溫箱培養(yǎng)4 h，小心吸盡培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜；輕輕振蕩溶解結(jié)晶之后上酶標(biāo)儀于490 nm處檢測(cè)吸光度（A）值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.6 遷移實(shí)驗(yàn) 收集轉(zhuǎn)染后72 h的三組細(xì)胞并計(jì)數(shù)，用1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/mL。將200 μL細(xì)胞懸液接種至Transwell小室的上室，下室添加700 μL含20%胎牛血清的1640培養(yǎng)基。溫箱培養(yǎng)12 h后用棉簽擦去上室表面的細(xì)胞。下室表面的細(xì)胞使用蘇木素染色2 min。顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察計(jì)數(shù)，計(jì)算平均穿膜細(xì)胞數(shù)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.7 流式細(xì)胞術(shù) 收集轉(zhuǎn)染后72 h的三組細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞，每管取5×105個(gè)細(xì)胞，然后按照凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書步驟操作如下：每管加50 μL Binding Buffer和5 μL 7-AAD的混合液，室溫避光反應(yīng)15 min。依次加入450 μL Binding Buffer和1 μL Annexin V-PE，室溫避光反應(yīng)15 min后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。每組重復(fù)3次。Apoptosis Detection Kit購(gòu)自凱基生物有限公司。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)數(shù)資料兩組間比較使用卡方檢驗(yàn)。計(jì)量資料實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Lenti-TCF21成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞 為了檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，我們用熒光顯微鏡對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)觀察計(jì)數(shù)。過(guò)表達(dá)組和空白載體組均見有綠色熒光蛋白表達(dá)，且在轉(zhuǎn)染72 h后觀察到熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，平均轉(zhuǎn)染效率為85%（圖1）。

2.2 熒光定量PCR檢測(cè)TCF21基因mRNA的表達(dá)水平 為了檢測(cè)TCF21是否過(guò)表達(dá)成功，我們對(duì)轉(zhuǎn)染后72 h的細(xì)胞進(jìn)行了更精確的熒光定量PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)組TCF21 mRNA表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)未處理組和空白載體組的TCF21 mRNA表達(dá)量（2,705.59±231.22 vs 1.00±0.31, 1.43±0.73）（P＜0.05）（圖2A）。

2.3 Western blot檢測(cè)TCF21蛋白的表達(dá)水平 為進(jìn)一步檢測(cè)TCF21蛋白是否表達(dá)成功，我們采用Western blot技術(shù)檢測(cè)三組細(xì)胞中TCF21蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示相對(duì)于未處理組，過(guò)表達(dá)組TCF21表達(dá)明顯增高，而空白載體組和未處理組未見明顯TCF21蛋白表達(dá)。這與熒光定量PCR的檢測(cè)結(jié)果一致，更進(jìn)一步說(shuō)明A549細(xì)胞中過(guò)表達(dá)了TCF21蛋白（圖2B）。

2.4 過(guò)表達(dá)TCF21對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 對(duì)轉(zhuǎn)染后的三組細(xì)胞采用MTT法進(jìn)行了細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：高表達(dá)組與空白載體組和未處理組比較，在24 h的檢測(cè)結(jié)果顯示三組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。而在48 h、72 h、96 h的檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組OD值明顯低于空白載體組和未處理組（0.44±0.02 vs 0.52±0.03, 0.54±0.04； 0.80±0.05 vs 1.35±0.06, 1.50±0.05； 1.08±0.08 vs 1.87±0.13, 1.96±0.10）（P＜0.05），而后兩者之間無(wú)明顯差異。說(shuō)明TCF21能夠在48 h以后明顯抑制肺癌細(xì)胞A549的增殖（圖2C）。

圖1 TCF21在肺癌細(xì)胞A549中的表達(dá)Fig 1 The overexpression of TCF21 in A549 lung cancer cells

圖2 TCF21在肺癌細(xì)胞A549中的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞增殖的影響。A：熒光定量PCR檢測(cè)TCF21 mRNA在各組中的表達(dá)量；B：Western blot檢測(cè)TCF21蛋白在各組中的表達(dá)量；C：MTT檢測(cè)過(guò)表達(dá)TCF21對(duì)各組細(xì)胞增殖的影響。Fig 2 The overexpression of TCF21 in A549 lung cancer cells and its influence on cell proliferation. A: Fluorescence quantitative polymerase chain reaction was used to analyze the expression of TCF21 mRNA； B: Western blot was used to analyze the expression of TCF21 protein； C: Proliferation assay were applied to test the impact of TCF21 expression on the cell proliferation of A549 after transfection.

2.5 過(guò)表達(dá)TCF21對(duì)A549細(xì)胞遷移能力的影響 我們對(duì)三組細(xì)胞進(jìn)行了Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移率要明顯低于空白載體組和未處理組（24.53±4.92 vs 54.53±8.57, 58.27±9.10）（P＜0.05）（圖3），而后兩者之間無(wú)明顯差異。這一結(jié)果說(shuō)明TCF21的過(guò)表達(dá)能夠明顯抑制肺癌細(xì)胞A549的遷移。

2.6 過(guò)表達(dá)TCF21對(duì)A549凋亡率的影響 在轉(zhuǎn)染后72 h使用流式細(xì)胞儀對(duì)三組細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞凋亡分析。結(jié)果顯示高表達(dá)TCF21蛋白的實(shí)驗(yàn)組較空白載體組和未處理組細(xì)胞凋亡率明顯上升（16.93±1.21 vs 1.29±0.32, 0.76±0.39,P＜0.05）且為早期凋亡，而后兩者之間無(wú)明顯差異。這一結(jié)果說(shuō)明TCF21的過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549發(fā)生早期凋亡（圖4）。

3 討論

研究[17-21]發(fā)現(xiàn)多種抑癌基因（如p53、PTEN、Rb等）在肺癌等腫瘤中存在缺失、突變或異常低表達(dá)等改變，且表達(dá)量隨腫瘤惡性程度的增高而降低。TCF21在多種腫瘤中存在啟動(dòng)子區(qū)甲基化，且其在腫瘤組織中的表達(dá)量較非腫瘤組織明顯降低[11-13]。本課題組前期關(guān)于TCF21表達(dá)和啟動(dòng)子區(qū)甲基化的研究也證實(shí)了這一結(jié)論[14]。另外有研究[11]顯示TCF21的表達(dá)量與患者的低生存率存在明顯相關(guān)性。并且TCF21的甲基化能夠通過(guò)患者的血樣檢測(cè)出來(lái)[13]，提示TCF21可能是一個(gè)潛在的腫瘤標(biāo)記物，并且檢測(cè)這種標(biāo)記物所需的樣品容易獲取，檢測(cè)十分方便。

本研究在組織水平的研究基礎(chǔ)上通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)一步探索TCF21的抑癌功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)TCF21能夠顯著抑制肺癌細(xì)胞A549生長(zhǎng)和引起細(xì)胞凋亡率的升高。本研究在前人的基礎(chǔ)上[22]有新的突破，TCF21對(duì)肺癌凋亡率的影響也部分解釋了TCF21為什么能夠抑制細(xì)胞增殖。同時(shí)也從側(cè)面支持了Smith等[22]的結(jié)論。近期有報(bào)道[15,16]稱TCF21能夠直接作用于KISS1基因，促使其表達(dá)上調(diào)，而KISS1能夠間接地觸發(fā)細(xì)胞凋亡[23]。那么TCF21是否是通過(guò)KISS1介導(dǎo)而實(shí)現(xiàn)促進(jìn)凋亡的作用，這一猜想尚需實(shí)驗(yàn)證實(shí)。另一方面TCF21是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，眾所周知，轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶II形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，共同參與多種轉(zhuǎn)錄起始的過(guò)程[24,25]。那么是否TCF21還參與KISS1以外的其他基因啟動(dòng)子區(qū)的調(diào)控，從而實(shí)現(xiàn)抑癌功能，這需要我們進(jìn)一步拓展研究。本研究通過(guò)肺腺癌細(xì)胞株A549來(lái)研究TCF21基因的抑癌功能及其機(jī)制，問題在于A549不能夠完全代表其他類型的非小細(xì)胞肺癌，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)不能夠完全模擬體內(nèi)生理環(huán)境，故實(shí)驗(yàn)存在一定的局限性。對(duì)于本研究中TCF21基因過(guò)表達(dá)引起的增殖抑制和細(xì)胞凋亡率增加，為進(jìn)一步確定其準(zhǔn)確性，應(yīng)該進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)量，在我們的后期研究中，我們會(huì)進(jìn)一步完成相關(guān)蛋白的檢測(cè)。這也為我們后期研究留下了空間。

圖3 TCF21過(guò)表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞A549遷移能力的影響。A：Transwell檢測(cè)三組細(xì)胞遷移能力。B：三組細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)圖。Fig 3 The impact of TCF21 overexpression on the cell migration of lung cancer cell A549. A:Transwell were applied to test the impact of TCF21 expression on the cell migration of A549 after transfection. B: Statistical figure of the numbers of cell permeating septum in three groups.

圖4 TCF21過(guò)表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞A549凋亡率的影響。A：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三組細(xì)胞凋亡率。B：三組細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)圖。Fig 4 The impact of TCF21 overexpression on apoptosis rate of lung cancer cell A549. A: Flow cytometry were applied to test the impact of TCF21 expression on the cell apoptosis of A549 after transfection； B: Statistical figure of apoptosis rate in three groups.

本研究的結(jié)果展示了TCF21的抑癌功能，同時(shí)也提示我們可以進(jìn)一步擴(kuò)展探索TCF21的其他功能，包括TCF21對(duì)肺癌細(xì)胞放療敏感性的影響，化療敏感性的影響，對(duì)裸鼠體內(nèi)成瘤能力的影響。這為我們展示了研究TCF21的巨大潛力。在我們的后期研究中我們將一方面致力于擴(kuò)展TCF21基因在肺癌細(xì)胞中的功能研究，并在裸鼠體內(nèi)做成瘤試驗(yàn)，以驗(yàn)證體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)論。另一方面致力于探索TCF21抑癌的具體機(jī)制，尋找其具體參與的分子調(diào)控機(jī)制。為肺癌的早期診斷和分子靶向治療提供依據(jù)。