利用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定土曲霉發(fā)酵液中衣康酸及殘?zhí)?/h1>
2014-09-08 03:34:53黃筱萍熊大維黃國(guó)昌
江西科學(xué) 2014年6期
劉 蘭，黃筱萍，熊大維，黃國(guó)昌，張 婷
(江西省科學(xué)院微生物研究所，330096，南昌)
利用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定土曲霉發(fā)酵液中衣康酸及殘?zhí)?/p>
劉 蘭，黃筱萍，熊大維，黃國(guó)昌，張 婷
(江西省科學(xué)院微生物研究所，330096，南昌)
建立了高效液相色譜(HPLC)快速測(cè)定土曲霉發(fā)酵液中衣康酸及殘?zhí)堑姆治龇椒?。使用TOSOH Tskgel oApak-A色譜柱，以0.75 mmol/L H2SO4為流動(dòng)相，在柱溫45 ℃，流速1.0 mL/min的條件下，采用示差折光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，該方法在20 min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)發(fā)酵液中衣康酸和葡萄糖的完全分離與定量。衣康酸在0～10.056 g/L范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)為0.33%，加標(biāo)回收率100.88%～102.74%。葡萄糖在0～6.016 g/L范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)為0.12%，加標(biāo)回收率101.26%～103.12%。該法適用于土黃霉發(fā)酵液中衣康酸和葡萄糖的快速、高效分離和定量測(cè)定。
高效液相色譜；衣康酸；葡萄糖；土曲霉；發(fā)酵液
0 引言
衣康酸(Itaconic acid)學(xué)名亞甲基丁二酸、甲叉丁二酸、亞甲基琥珀酸[1]，是世界上5大有機(jī)酸之一。由于其含不飽和雙鍵，具有活潑的化學(xué)性質(zhì)，能進(jìn)行各種加成反應(yīng)，酯化反應(yīng)和聚合反應(yīng)，是化學(xué)合成和化工生產(chǎn)的重要工業(yè)原料，在化纖、合成樹脂、塑料、橡膠、醫(yī)藥、表面活性劑以及食品領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，隨著衣康酸具有的獨(dú)特性能被認(rèn)識(shí)及應(yīng)用范圍的迅速擴(kuò)大，衣康酸的生產(chǎn)技術(shù)也在不斷進(jìn)步[2]。
發(fā)酵法生產(chǎn)衣康酸由于原料易得，工藝技術(shù)成熟，是目前國(guó)內(nèi)外工業(yè)生產(chǎn)一致采用的方法[4]。測(cè)定衣康酸發(fā)酵液中殘?zhí)羌耙驴邓岬淖兓?，?duì)揭示代謝途徑以及控制發(fā)酵過(guò)程，從而優(yōu)化發(fā)酵工藝條件意義重大。目前，衣康酸發(fā)酵液中的衣康酸采用Friedkin碘量法測(cè)定，還原糖采用DNS法(3,5-二硝基水楊酸比色法)或菲林試劑滴定法測(cè)定[3-5]。由于采用多種分析手段分析發(fā)酵液，過(guò)程繁瑣費(fèi)時(shí)。因此針對(duì)衣康酸發(fā)酵工藝建立快速、準(zhǔn)確地同時(shí)測(cè)定衣康酸和殘?zhí)堑姆治龇椒▽?duì)于衣康酸發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展具有重要的意義。白冬梅等使用反相高效液相色譜法同時(shí)分析了發(fā)酵液中有機(jī)酸和葡萄糖[6-7]。馬瑞等使用離子排斥液相色譜法同時(shí)分析了6種有機(jī)酸和3種糖類物質(zhì)[8]。
本研究采用HPLC法，利用TOSOH Tskgel oApak-A色譜柱，以示差折光檢測(cè)器(RID)檢測(cè)，建立了同時(shí)檢測(cè)土曲霉發(fā)酵液中葡萄糖和衣康酸的方法。該方法可以較準(zhǔn)確地測(cè)定衣康酸發(fā)酵過(guò)程中糖的消耗量及衣康酸代謝產(chǎn)物的生成量，這對(duì)于控制發(fā)酵過(guò)程，優(yōu)化發(fā)酵工藝條件及操作參數(shù)，從而提高衣康酸產(chǎn)量具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1儀器與試劑
日本島津(Shimadzu)LC-20A高效液相色譜儀(配示差折光檢測(cè)器，島津LC電腦工作站)；Practum224-1CN電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；FDY0501-UV-P超純水設(shè)備(青島富勒科技有限公司)；H2500R-2高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀)。
衣康酸(純度為99%；CAS號(hào)97-65-4)；葡萄糖(純度為99.5%；CAS號(hào)：55-99-7)。
1.2色譜條件
色譜柱：TOSOH Tskgel oApak-A(300 mm×7.8mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.75 mmol/L H2SO4；流速：1.0 mL/min；柱溫：45 ℃；檢測(cè)器：RID；進(jìn)樣量：10 μL；外標(biāo)法定量。
1.3樣品溶液配制
1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取烘干至恒重的分析純葡萄糖5.013 4 g，用超純水溶解，定容至100 mL，配成50.13 4 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為儲(chǔ)備液。然后分別從儲(chǔ)備液中精密量取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL至50 mL容量瓶中，加超純水定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1.002 7 g/L、2.005 4 g/L、3.008 0 g/L、4.010 7 g/L、5.013 4 g/L、6.016 1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
準(zhǔn)確稱取衣康酸標(biāo)準(zhǔn)品2.031 5 g(純度為99%)，用超純水溶解，定容至100 mL，配成20.112 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為儲(chǔ)備液。然后分別從儲(chǔ)備液中精密量取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL至10 mL容量瓶中, 加超純水定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為2.0112 g/L、4.022 4 g/L、6.033 6 g/L、8.044 8 g/L、10.056 0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
1.3.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 稱取衣康酸0.710 6 g及葡萄糖0.505 9 g，用超純水溶解至100 mL，配制含衣康酸和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的混合溶液，2組份的質(zhì)量濃度見表1。
表1 衣康酸及葡萄糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的組成
1.4定性和定量
在相同色譜條件下，將樣品色譜圖與衣康酸以及葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液色譜圖對(duì)照，根據(jù)保留時(shí)間確定樣品中各組分的色譜峰；在標(biāo)樣與樣品進(jìn)樣量相同的情況下，應(yīng)用外標(biāo)法定量，計(jì)算樣品中各組分的含量。
2 結(jié)果與討論
2.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的確定
在1.2節(jié)的色譜條件下分別測(cè)定衣康酸和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，確定各組分的保留時(shí)間(衣康酸的色譜圖見圖1；葡萄糖的色譜圖見圖2)；再測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖(見圖3)，從圖3可以看出衣康酸和葡萄糖的分離效果很好，出峰順序?yàn)槠咸烟?、衣康酸?/p>
圖1 衣康酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖
圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖
圖3 葡萄糖和衣康酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖
2.2色譜條件的選擇
本實(shí)驗(yàn)根據(jù)色譜柱的特性對(duì)分析溫度及流速進(jìn)行了考察，確定最佳分析條件。
2.2.1 柱溫的選擇 分別考察了柱溫為35 ℃、40 ℃、45 ℃時(shí)的分離情況，從圖4中可看出柱溫對(duì)葡萄糖和衣康酸的分離度影響不大，衣康酸保留時(shí)間稍提前，且柱壓降低?？紤]柱壓低可延長(zhǎng)分析柱的的壽命，本實(shí)驗(yàn)將柱溫定為45 ℃。
2.2.2 流速的選擇 流動(dòng)相的流速對(duì)液相色譜的分離有影響，流速分別設(shè)定為0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min，進(jìn)行考察。從圖4中可看出，隨著流速的增加，保留時(shí)間都有提前，但柱壓增大，峰面積減小，說(shuō)明靈敏度下降，綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇流速為1.0 mL/min。
圖4 柱溫及流速對(duì)葡萄糖和衣康酸混合溶液保留時(shí)間的影響
2.3標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制作
將1.3.1配制的葡萄糖及衣康酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按10 μL進(jìn)樣量分別進(jìn)行分析，記錄各質(zhì)量濃度得到的峰面積A，將各峰面積A與對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度C(g/L)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。
表2 衣康酸和葡萄糖的保留時(shí)間、線性關(guān)系
2.4重復(fù)性(精密度)和回收率(準(zhǔn)確度)
2.4.1 重復(fù)性(精密度)實(shí)驗(yàn) 將搖瓶發(fā)酵一定時(shí)間的發(fā)酵液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，作為試驗(yàn)樣品，按色譜條件，進(jìn)樣分析得色譜圖5，可見葡萄糖出峰時(shí)間9.130 min，衣康酸出峰時(shí)間18.332 min，兩者分離效果好，其它雜質(zhì)低。連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得結(jié)果見表3，葡萄糖和衣康酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.11%、0.33%。
圖5 土曲霉搖瓶發(fā)酵液色譜圖
表3 土曲霉發(fā)酵液的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果
2.4.2 加標(biāo)回收率(準(zhǔn)確度)實(shí)驗(yàn) 加標(biāo)回收率的測(cè)定，是對(duì)所建立分析方法適用性及系統(tǒng)誤差的檢驗(yàn)，也是分析質(zhì)量控制的一種手段。本實(shí)驗(yàn)以稀釋一定倍數(shù)的發(fā)酵液作為試驗(yàn)樣品，平行取樣6次進(jìn)行2個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見表4，得到葡萄糖和衣康酸的加標(biāo)回收率在100.88%～103.12%之間。
表4土曲霉發(fā)酵液中葡萄糖和衣康酸的加標(biāo)回收率(n=6)
CompoundBackground/g·L-1Added/g·L-1Found/g·L-1Recovery/%Glucose2．46711．50513．01024．09615．5463103．12101．26Itaconicacid3．0643．01686．03366．24769．1778102．74100．88
3 結(jié)論
1)采用HPLC對(duì)土曲霉發(fā)酵液中衣康酸及葡萄糖含量進(jìn)行檢測(cè)，確定了最佳色譜條件：TOSOH Tskgel oApak-A色譜柱，示差檢測(cè)器(RID)，流動(dòng)相0.75 mmol/L H2SO4，流速1.0 mL/min，柱溫45 ℃。
2)該方法前處理簡(jiǎn)單、精密度好、靈敏度高，比常規(guī)化學(xué)滴定法省時(shí)、省力，為衣康酸發(fā)酵工藝改進(jìn)的研究及適時(shí)監(jiān)控提供了方便。
[1] 劉建軍,姜魯燕,李丕武,等.衣康酸的性質(zhì)、生產(chǎn)及應(yīng)用[J].山東科學(xué),2002,15(3):38-42.
[2]何敏超,張宇,許敬亮,等.衣康酸產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)狀和展望[J].中國(guó)釀造,2012,31(11):8-11.
[3]賈士儒,王明霞,陳貴斌,等.衣康酸發(fā)酵工藝的初步研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),1999,25(2):39-42.
[4]劉建軍,姜魯燕,李丕武,等.發(fā)酵法生產(chǎn)衣康酸技術(shù)的研究-衣康酸發(fā)酵工藝條件的研究(Ⅱ)[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2003,29(4):27-32.
[5]徐建春,李霞,王海英.發(fā)酵法生產(chǎn)衣康酸-高產(chǎn)菌株的選育[J].發(fā)酵科技通訊,2008,37(1):30-32.
[6]白冬梅,杜國(guó)民,沈菲,等.反相HPLC同時(shí)測(cè)定產(chǎn)琥珀酸放線桿菌發(fā)酵液中的有機(jī)酸與葡萄糖[J].分析試驗(yàn)室,2004,23(3):15-18.
[7]白冬梅,趙學(xué)明,胡宗定,等.反相HPLC雙控檢測(cè)器法同時(shí)測(cè)定米根霉乳酸發(fā)酵液中的有機(jī)酸與葡萄糖[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2000,27(11):13-17.
[8]馬瑞,歐陽(yáng)嘉,李鑫,等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定生物質(zhì)乳酸發(fā)酵液中有機(jī)酸及糖類化合物[J].色譜,2012,30(1):62-66.
SimultaneousdeterminationofItaconicAcidandSaccharidesinItaconicAcidFermentationBrothofAspergillusterreusbyHighPerformanceLiquidChromatography
LIU Lan,HUANG Xiaoping,XIONG Dawei,HUANG Guochang,ZHANG Ting
(Jiangxi Academy of Science. Institute of Microbiology,330096,Nanchang,PRC)
A high performance liquid chromatographic method for rapid determination of itaconic acid and saccharides in itaconic acid fermentation broth ofAspergillusterreuswas developed.A TOSOH Tskgel oApak-A column was used at 45 ℃ and the mobile phase was 0.75 mmol/L H2SO4at a flow rate of 1.0 mL/min.Under the optimized conditions.The itaconic acid and glucose in samples were determined and completely separated within 20 min by a refractive index detector (RID).The Linear correlation coefficient for itaconic acid was 0.999 9 in the range of 0～10.056 g/L.The Linear correlation coefficient for glucose was 0.999 9 in the range of 0～6.016 g/L.The relative standard deviation (RSD,n=6) of itaconic acid and glucose was 0.33% and 0.15% respectively.The recovery rate was 100.88%～102.74% and of 101.26%～103.12% separately.This method established is proved to be fast and accurate for the quantitative analysis of the itaconic acid and glucose in fermentation broth ofAspergillusterreus.
high performance liquid chromatography(HPLC);itaconic acid;glucose;Aspergillusterreus;fermentation broth
2014-10-13;
2014-11-17
劉 蘭(1969-)，女，本科，研究方向：有機(jī)酸發(fā)酵。
10.13990/j.issn1001-3679.2014.06.027
O658
A
1001-3679(2014)06-0865-04
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高效液相色譜；衣康酸；葡萄糖；土曲霉；發(fā)酵液
0 引言
衣康酸(Itaconic acid)學(xué)名亞甲基丁二酸、甲叉丁二酸、亞甲基琥珀酸[1]，是世界上5大有機(jī)酸之一。由于其含不飽和雙鍵，具有活潑的化學(xué)性質(zhì)，能進(jìn)行各種加成反應(yīng)，酯化反應(yīng)和聚合反應(yīng)，是化學(xué)合成和化工生產(chǎn)的重要工業(yè)原料，在化纖、合成樹脂、塑料、橡膠、醫(yī)藥、表面活性劑以及食品領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，隨著衣康酸具有的獨(dú)特性能被認(rèn)識(shí)及應(yīng)用范圍的迅速擴(kuò)大，衣康酸的生產(chǎn)技術(shù)也在不斷進(jìn)步[2]。
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本研究采用HPLC法，利用TOSOH Tskgel oApak-A色譜柱，以示差折光檢測(cè)器(RID)檢測(cè)，建立了同時(shí)檢測(cè)土曲霉發(fā)酵液中葡萄糖和衣康酸的方法。該方法可以較準(zhǔn)確地測(cè)定衣康酸發(fā)酵過(guò)程中糖的消耗量及衣康酸代謝產(chǎn)物的生成量，這對(duì)于控制發(fā)酵過(guò)程，優(yōu)化發(fā)酵工藝條件及操作參數(shù)，從而提高衣康酸產(chǎn)量具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1儀器與試劑
日本島津(Shimadzu)LC-20A高效液相色譜儀(配示差折光檢測(cè)器，島津LC電腦工作站)；Practum224-1CN電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；FDY0501-UV-P超純水設(shè)備(青島富勒科技有限公司)；H2500R-2高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀)。
衣康酸(純度為99%；CAS號(hào)97-65-4)；葡萄糖(純度為99.5%；CAS號(hào)：55-99-7)。
1.2色譜條件
色譜柱：TOSOH Tskgel oApak-A(300 mm×7.8mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.75 mmol/L H2SO4；流速：1.0 mL/min；柱溫：45 ℃；檢測(cè)器：RID；進(jìn)樣量：10 μL；外標(biāo)法定量。
1.3樣品溶液配制
1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取烘干至恒重的分析純葡萄糖5.013 4 g，用超純水溶解，定容至100 mL，配成50.13 4 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為儲(chǔ)備液。然后分別從儲(chǔ)備液中精密量取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL至50 mL容量瓶中，加超純水定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1.002 7 g/L、2.005 4 g/L、3.008 0 g/L、4.010 7 g/L、5.013 4 g/L、6.016 1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
準(zhǔn)確稱取衣康酸標(biāo)準(zhǔn)品2.031 5 g(純度為99%)，用超純水溶解，定容至100 mL，配成20.112 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為儲(chǔ)備液。然后分別從儲(chǔ)備液中精密量取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL至10 mL容量瓶中, 加超純水定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為2.0112 g/L、4.022 4 g/L、6.033 6 g/L、8.044 8 g/L、10.056 0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
1.3.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 稱取衣康酸0.710 6 g及葡萄糖0.505 9 g，用超純水溶解至100 mL，配制含衣康酸和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的混合溶液，2組份的質(zhì)量濃度見表1。
表1 衣康酸及葡萄糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的組成
1.4定性和定量
在相同色譜條件下，將樣品色譜圖與衣康酸以及葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液色譜圖對(duì)照，根據(jù)保留時(shí)間確定樣品中各組分的色譜峰；在標(biāo)樣與樣品進(jìn)樣量相同的情況下，應(yīng)用外標(biāo)法定量，計(jì)算樣品中各組分的含量。
2 結(jié)果與討論
2.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的確定
在1.2節(jié)的色譜條件下分別測(cè)定衣康酸和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，確定各組分的保留時(shí)間(衣康酸的色譜圖見圖1；葡萄糖的色譜圖見圖2)；再測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖(見圖3)，從圖3可以看出衣康酸和葡萄糖的分離效果很好，出峰順序?yàn)槠咸烟?、衣康酸?/p>
圖1 衣康酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖
圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖
圖3 葡萄糖和衣康酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖
2.2色譜條件的選擇
本實(shí)驗(yàn)根據(jù)色譜柱的特性對(duì)分析溫度及流速進(jìn)行了考察，確定最佳分析條件。
2.2.1 柱溫的選擇 分別考察了柱溫為35 ℃、40 ℃、45 ℃時(shí)的分離情況，從圖4中可看出柱溫對(duì)葡萄糖和衣康酸的分離度影響不大，衣康酸保留時(shí)間稍提前，且柱壓降低?？紤]柱壓低可延長(zhǎng)分析柱的的壽命，本實(shí)驗(yàn)將柱溫定為45 ℃。
2.2.2 流速的選擇 流動(dòng)相的流速對(duì)液相色譜的分離有影響，流速分別設(shè)定為0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min，進(jìn)行考察。從圖4中可看出，隨著流速的增加，保留時(shí)間都有提前，但柱壓增大，峰面積減小，說(shuō)明靈敏度下降，綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇流速為1.0 mL/min。
圖4 柱溫及流速對(duì)葡萄糖和衣康酸混合溶液保留時(shí)間的影響
2.3標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制作
將1.3.1配制的葡萄糖及衣康酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按10 μL進(jìn)樣量分別進(jìn)行分析，記錄各質(zhì)量濃度得到的峰面積A，將各峰面積A與對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度C(g/L)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。
表2 衣康酸和葡萄糖的保留時(shí)間、線性關(guān)系
2.4重復(fù)性(精密度)和回收率(準(zhǔn)確度)
2.4.1 重復(fù)性(精密度)實(shí)驗(yàn) 將搖瓶發(fā)酵一定時(shí)間的發(fā)酵液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，作為試驗(yàn)樣品，按色譜條件，進(jìn)樣分析得色譜圖5，可見葡萄糖出峰時(shí)間9.130 min，衣康酸出峰時(shí)間18.332 min，兩者分離效果好，其它雜質(zhì)低。連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得結(jié)果見表3，葡萄糖和衣康酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.11%、0.33%。
圖5 土曲霉搖瓶發(fā)酵液色譜圖
表3 土曲霉發(fā)酵液的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果
2.4.2 加標(biāo)回收率(準(zhǔn)確度)實(shí)驗(yàn) 加標(biāo)回收率的測(cè)定，是對(duì)所建立分析方法適用性及系統(tǒng)誤差的檢驗(yàn)，也是分析質(zhì)量控制的一種手段。本實(shí)驗(yàn)以稀釋一定倍數(shù)的發(fā)酵液作為試驗(yàn)樣品，平行取樣6次進(jìn)行2個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見表4，得到葡萄糖和衣康酸的加標(biāo)回收率在100.88%～103.12%之間。
表4土曲霉發(fā)酵液中葡萄糖和衣康酸的加標(biāo)回收率(n=6)
CompoundBackground/g·L-1Added/g·L-1Found/g·L-1Recovery/%Glucose2．46711．50513．01024．09615．5463103．12101．26Itaconicacid3．0643．01686．03366．24769．1778102．74100．88
3 結(jié)論
1)采用HPLC對(duì)土曲霉發(fā)酵液中衣康酸及葡萄糖含量進(jìn)行檢測(cè)，確定了最佳色譜條件：TOSOH Tskgel oApak-A色譜柱，示差檢測(cè)器(RID)，流動(dòng)相0.75 mmol/L H2SO4，流速1.0 mL/min，柱溫45 ℃。
2)該方法前處理簡(jiǎn)單、精密度好、靈敏度高，比常規(guī)化學(xué)滴定法省時(shí)、省力，為衣康酸發(fā)酵工藝改進(jìn)的研究及適時(shí)監(jiān)控提供了方便。
[1] 劉建軍,姜魯燕,李丕武,等.衣康酸的性質(zhì)、生產(chǎn)及應(yīng)用[J].山東科學(xué),2002,15(3):38-42.
[2]何敏超,張宇,許敬亮,等.衣康酸產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)狀和展望[J].中國(guó)釀造,2012,31(11):8-11.
[3]賈士儒,王明霞,陳貴斌,等.衣康酸發(fā)酵工藝的初步研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),1999,25(2):39-42.
[4]劉建軍,姜魯燕,李丕武,等.發(fā)酵法生產(chǎn)衣康酸技術(shù)的研究-衣康酸發(fā)酵工藝條件的研究(Ⅱ)[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2003,29(4):27-32.
[5]徐建春,李霞,王海英.發(fā)酵法生產(chǎn)衣康酸-高產(chǎn)菌株的選育[J].發(fā)酵科技通訊,2008,37(1):30-32.
[6]白冬梅,杜國(guó)民,沈菲,等.反相HPLC同時(shí)測(cè)定產(chǎn)琥珀酸放線桿菌發(fā)酵液中的有機(jī)酸與葡萄糖[J].分析試驗(yàn)室,2004,23(3):15-18.
[7]白冬梅,趙學(xué)明,胡宗定,等.反相HPLC雙控檢測(cè)器法同時(shí)測(cè)定米根霉乳酸發(fā)酵液中的有機(jī)酸與葡萄糖[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2000,27(11):13-17.
[8]馬瑞,歐陽(yáng)嘉,李鑫,等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定生物質(zhì)乳酸發(fā)酵液中有機(jī)酸及糖類化合物[J].色譜,2012,30(1):62-66.
SimultaneousdeterminationofItaconicAcidandSaccharidesinItaconicAcidFermentationBrothofAspergillusterreusbyHighPerformanceLiquidChromatography
LIU Lan,HUANG Xiaoping,XIONG Dawei,HUANG Guochang,ZHANG Ting
(Jiangxi Academy of Science. Institute of Microbiology,330096,Nanchang,PRC)
A high performance liquid chromatographic method for rapid determination of itaconic acid and saccharides in itaconic acid fermentation broth ofAspergillusterreuswas developed.A TOSOH Tskgel oApak-A column was used at 45 ℃ and the mobile phase was 0.75 mmol/L H2SO4at a flow rate of 1.0 mL/min.Under the optimized conditions.The itaconic acid and glucose in samples were determined and completely separated within 20 min by a refractive index detector (RID).The Linear correlation coefficient for itaconic acid was 0.999 9 in the range of 0～10.056 g/L.The Linear correlation coefficient for glucose was 0.999 9 in the range of 0～6.016 g/L.The relative standard deviation (RSD,n=6) of itaconic acid and glucose was 0.33% and 0.15% respectively.The recovery rate was 100.88%～102.74% and of 101.26%～103.12% separately.This method established is proved to be fast and accurate for the quantitative analysis of the itaconic acid and glucose in fermentation broth ofAspergillusterreus.
high performance liquid chromatography(HPLC);itaconic acid;glucose;Aspergillusterreus;fermentation broth
2014-10-13;
2014-11-17
劉 蘭(1969-)，女，本科，研究方向：有機(jī)酸發(fā)酵。
10.13990/j.issn1001-3679.2014.06.027
O658
A
1001-3679(2014)06-0865-04
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