氧化苦參堿防治慢性腎纖維化機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究

陳晨 金玉 西安市兒童醫(yī)院新生兒科 （西安 710003）

腎病綜合征（nephrotic syndrome，NS）是小兒常見(jiàn)病、多發(fā)病，它是一種病理類型各異、臨床病程不同、預(yù)后差別很大的綜合征。據(jù)國(guó)內(nèi)統(tǒng)計(jì)，在因泌尿系統(tǒng)疾病住院的患兒中，本征僅次于急性腎炎，部分患兒病情反復(fù)發(fā)作，病程遷延不愈，嚴(yán)重影響小兒健康。半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，隨著有效抗菌藥物、腎上腺皮質(zhì)激素和免疫抑制劑的相繼問(wèn)世，小兒腎病綜合征的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸有了顯著的變化，但仍有部分患兒病情遷延不愈，腎功能進(jìn)行性惡化，最終轉(zhuǎn)歸為慢性腎功能衰竭（chronic renal failure，CRF），這種轉(zhuǎn)歸最終形成以腎臟纖維化為病理基礎(chǔ)的終末腎。小兒腎病的研究重點(diǎn)和難點(diǎn)就落在了如何防治不可逆的腎臟纖維化的發(fā)生，以提高患兒遠(yuǎn)期存活率與生存質(zhì)量。NF-κB是一個(gè)具有多向性調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子，參與了多種炎癥性細(xì)胞因子、趨化因子、促纖維化因子的合成，細(xì)胞增殖、ECM交聯(lián)、細(xì)胞凋亡和成纖維細(xì)胞等的分化過(guò)程[1]。NF-κB與抑制性－κB（inhibitory kappa B，IκB）構(gòu)成了 NF－κB／IκB信號(hào)傳導(dǎo)通路，這就為研究腎臟纖維化的機(jī)理提供了重要的研究方向。近年來(lái)氧化苦參堿（OM）由于具有多方面的藥理活性而引起了人們廣泛的重視和興趣，已有許多研究表明氧化苦參堿在抗肝纖維化和皮膚纖維化中有一定療效[2，3]。為此，我們?cè)⒘舜笫舐岳w維化模型，通過(guò)分析大鼠腎組織中 TGF－β1／Smads、NF-κB／IκB信號(hào)傳導(dǎo)通路，發(fā)現(xiàn)OM對(duì)慢性腎臟損害有保護(hù)作用[4，5]。本研究是在前期工作基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究不同濃度組氧化苦參堿對(duì)腎纖維化的抑制作用，為OM早日應(yīng)用臨床提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑 氧化苦參堿，寧夏紫荊花藥業(yè)有限公司，批號(hào)40040909；苯鈉普利，北京諾華制藥有限公司，10mg×14片，批號(hào)04121；鹽酸阿霉素10mg／瓶，浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)040801。鼠抗人NF-κB P65單克隆抗體、兔抗人IκBα多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruse公司；PV-6001，PV-6002二步法免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 動(dòng) 物 大鼠：Wistar大鼠150只，雄性。2月齡，體重180～210g，購(gòu)自蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物室。

1.3 模型的制備與分組 150只Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組（A組）、模型對(duì)照組（B組）、苯鈉普利治療組（C組）、OM 50mg／kg治療組（D組）、OM 100mg／kg治療組（E組）。每組30只，其中B、C、D、E組大鼠分別于實(shí)驗(yàn)第1d、第21d尾靜脈注射阿霉素（2mg／kg·d），A組予等量生理鹽水[6]，C、D、E組于第2次注射后分別給予苯鈉普利6mg／kg·d、OM 50mg／kg·d、OM100mg／kg·d灌胃，A組予等量生理鹽水灌胃直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。以上各組動(dòng)物分籠喂養(yǎng)，給予普通飼料及自由飲水。各組大鼠在第2次注射后4周、8周、12周、16周、20周、24周分6批處死進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.4 24h尿蛋白及血生化檢測(cè) 采用三氯乙酸法于第1次注射前和第2次注射后第1d收集24h尿液測(cè)蛋白（第1次注藥前為0周），之后以第2次注藥后計(jì)算周數(shù)，每隔4周測(cè)1次尿蛋白。于4周、8周、12周、16周、20周、24周末處死大鼠之前取股靜脈血，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清白蛋白（albumin，Alb）、肌酐（creatinine ，Cr）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）。

1.5 腎臟病理檢查 大鼠處死后立即用10%福爾馬林固定腎組織，常規(guī)石蠟包埋，切片厚4μm，行HE染色后觀察腎臟的病理改變。參照Raij等[7]的方法評(píng)估腎小球硬化程度，然后計(jì)算腎小球硬化指數(shù)（glomerulosclerosis index，GSI）表示腎小球硬化程度。

1.6 采用PV二步法檢測(cè)腎組織中的NF－κB、IκB 主要操作步驟為：取4μm厚的10%甲醛固定的石蠟切片，常規(guī)脫蠟水化，浸入3%過(guò)氧化氫（H2O2）5min，PBS沖洗3次，滴加稀釋的一抗（NF-κB P65單克隆抗體和IκBα多克隆抗體均為1∶50稀釋度）滴加適量山羊抗小鼠（或兔）IgG抗體－HRP多聚體，PBS沖洗3次3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色。蘇木素輕度復(fù)染，脫水、透明、封片、鏡檢腎實(shí)質(zhì)及間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)有棕褐色顆粒為陽(yáng)性。結(jié)果采用Olympus BX50圖像分析定量?jī)x，每張切片在400倍下隨即選取15個(gè)腎小球，計(jì)算每個(gè)腎小球內(nèi)抗體染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，以均值表示每例腎小球中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)；20個(gè)高倍視野下陽(yáng)性腎小管數(shù)占總腎小管數(shù)的百分?jǐn)?shù)，均值表示每例腎小管中的陽(yáng)性率[8]。

2 結(jié) 果

2.1 24h尿蛋白檢測(cè)結(jié)果 在第2次注藥后的第1d，B、C、D、E組的24h尿蛋白排出量較A組開(kāi)始增多（P＜0.01），B組的尿蛋白于16周末達(dá)到高峰，之后維持在較高水平，而C、D、E三組的尿蛋白排出量于第4周后開(kāi)始低于B組（P＜0.01），以后尿蛋白有所增加，但均不明顯；12周后，C、E兩組的尿蛋白水平低于D組（P＜0.01），但C、E間差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。

2.2 血生化檢測(cè)結(jié)果 B組大鼠Alb于第8周開(kāi)始較A組顯著降低（P＜0.05），D組大鼠的Alb于第12周后較A組顯著降低（P＜0.05），C、E兩組的Alb于20周開(kāi)始高于B組而低于A組（P＜0.05），第24周時(shí)，E組的Alb低于D組（P＜0.05），其他時(shí)期C、D、E三組間差異無(wú)顯著性（P＞0.05）；B組大鼠BUN、Cr在第12周后較A、C、D、E組增多（P＜0.01），24周時(shí)，D組BUN高于A組（P＜0.05）而C、D、E組Cr高于 A組（P＜0.05），其他時(shí)期C、D、E三組間差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。

2.3 腎臟病理改變 光鏡下4周末各組大鼠腎組織未見(jiàn)明顯改變；8周末B組大鼠腎組織中部分腎小球細(xì)胞可見(jiàn)空泡變性，12周時(shí)可見(jiàn)腎小球系膜細(xì)胞輕度增生，腎小球代償性肥大；16周時(shí)腎小球系膜細(xì)胞呈中度增生，系膜區(qū)增寬，部分毛細(xì)血管腔變窄甚至完全閉塞，20周時(shí)少數(shù)小球內(nèi)可見(jiàn)球囊粘連，局灶、節(jié)段性硬化；24周時(shí)上述病變加重，部分小球呈全球硬化，并發(fā)生玻璃樣變性。C、D、E組大鼠的腎小球硬化較輕，20周時(shí)才與A組具有顯著性差異（P＜0.05）。腎小管和間質(zhì)結(jié)構(gòu)在從第4周開(kāi)始可見(jiàn)遠(yuǎn)曲小管蛋白管型；16周后遠(yuǎn)曲小管蛋白管型明顯增多，20周后部分近曲小管萎縮，小管上皮細(xì)胞腫脹，顆粒變性，壞死、脫落明顯，間質(zhì)單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維化；24周時(shí)，以上病變加重，在萎縮的腎小管周圍可見(jiàn)纖維化組織包圍。C、D、E組的腎小管和間質(zhì)改變較輕。

2.4 NF-κB在阿霉素大鼠腎組織中的表達(dá)（見(jiàn)圖1～4）A組大鼠腎組織可見(jiàn)少許腎小球系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞有較弱的 NF-κB表達(dá)，8周后 B、C、D、E腎組織 NF-κB的表達(dá)與A組相比顯著增強(qiáng)（P＜0.01），并且隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)，主要見(jiàn)于腎小球系膜細(xì)胞、腎小球囊側(cè)壁上皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞。如表1所示，C、D、E組第8周后較B組大鼠腎組織中NF-κB的表達(dá)顯著下降（P＜0.01），C、E兩組腎小球及腎小管NF－κB的表達(dá)分別在16周和12周后低于D組（P＜0.05），但C、E兩組間比較差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。

圖1～4 各組24周末NF－κB指標(biāo)的表達(dá) （免疫組化染色×200）

2.5 IκB在阿霉素大鼠腎組織中的表達(dá)（見(jiàn)圖5～8） A組大鼠腎組織中IκB表達(dá)水平較高，主要表達(dá)于腎小球系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞；B、D組腎組織表達(dá)明顯減弱，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸降低的趨勢(shì)，如表2所示，C、D、E組大鼠腎小球和腎小管中IκB的表達(dá)在第8周后低于A組高于B組（P＜0.01），C、E兩組腎組織中IκB的表達(dá)于16周后高于D組（P＜0.05），C、E兩組間比較差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。

表1 各組大鼠不同時(shí)期NF-κB在腎組織中的表達(dá)（，n＝5）

表1 各組大鼠不同時(shí)期NF-κB在腎組織中的表達(dá)（，n＝5）

注：△與A組相比，P＜0.01；▲與B組相比，P＜0.05；◇與D組相比，P＜0.05

組 別 4周 8周 12周 16周 20周 24周腎小球（個(gè)／gcs）A 1.33±0.98 1.27±0.88 1.40±0.83 1.20±0.94 1.13±0.92 1.33±1.05 B 3.80±0.86△ 6.00±1.46△ 8.20±1.21△ 10.07±2.43△ 10.53±1.60△ 11.20±1.61△C 2.67±0.72△▲ 2.93±0.96△▲ 4.27±0.88△▲ 4.87±1.41△▲◇ 5.00±1.69△▲◇ 5.27±1.62△▲◇D 3.07±0.80△ 3.93±0.96△▲ 5.13±2.17△▲ 7.40±1.59△▲ 8.33±2.19△▲ 9.40±2.16△▲E 2.60±0.91△▲ 3.20±0.86△▲ 4.07±1.39△▲ 5.07±1.59△▲◇ 5.40±1.72△▲◇ 5.47±1.36△▲◇腎小管（%）A 6.60±2.35 7.10±2.29 6.75±2.17 6.70±2.27 6.90±3.08 7.30±3.06 B 19.70±4.51△ 22.90±3.86△ 28.80±4.37△ 31.20±3.69△ 32.90±5.56△ 35.40±5.47△C 11.70±2.77△▲ 13.50±3.55△▲ 14.6±3.32△▲◇ 14.8±3.86△▲◇ 16.80±3.0△▲◇ 17.00±3.58△▲◇D 14.10±2.29△▲ 16.10±2.86△▲ 19.9±3.28△▲ 22.1±4.33△▲ 22.80±3.86△▲ 24.20±3.72△▲E 11.20±3.52△▲ 12.90±2.94△▲◇ 14.7±3.13△▲◇ 15.0±3.00△▲◇ 16.10±4.18△▲◇18.10±4.18△▲◇

圖5～8 各組24周末IκB指標(biāo)的表達(dá) （免疫組化染色×200）

表2 各組大鼠不同時(shí)期IκB在腎組織中的表達(dá)（，n＝5）

表2 各組大鼠不同時(shí)期IκB在腎組織中的表達(dá)（，n＝5）

注：△與A組相比，P＜0.01；▲與B組相比，P＜0.01，◇與D組相比，P＜0.05

組 別 4周 8周 12周 16周 20周 24周腎小球（個(gè)／gcs）A 20.67±3.11 21.13±3.00 21.20±2.83 20.93±2.81 21.33±2.87 20.87±2.56 B 7.78±1.81△ 6.40±1.24△ 4.40±1.50△ 3.60±1.18△ 2.93±1.44△ 2.73±1.16△C 18.13±32▲ 15.67±2.50△▲ 14.40±2.32△▲◇14.00±2.80△▲◇13.13±2.20△▲◇12.33±2.53△▲◇D 16.80±3.05△▲ 14.00±2.54△▲ 11.87±2.45△▲ 9.93±2.34△▲ 6.33±1.29△▲ 6.20±2.14△▲E 17.93±3.47▲ 16.07±2.91△▲ 14.27±2.43△▲ 14.07±2.66△▲◇13.67±2.13△▲◇13.07±2.52△▲◇腎小管（%）A 47.10±7.93 48.20±8.89 48.1±8.67 47.90±6.21 47.70±7.15 47.60±7.04 B 23.20±4.70△ 20.00±4.63△ 16.40±5.79△ 16.20±4.40△ 15.60±7.1△ 15.00±4.47△C 43.20±5.93▲ 41.30±7.41△▲ 38.30±7.09△▲ 35.30±6.27△▲◇33.60±7.91△▲◇31.50±5.80△▲◇D 36.90±9.28△▲ 36.80±7.80△▲ 31.80±9.75△▲ 29.40±4.95△▲ 26.80±5.93△▲ 25.90±5.64△▲E 41.70±7.00▲ 41.50±7.51▲ 37.40±7.32△▲ 36.10±6.82△▲◇33.00±5.33△▲◇31.30±5.04△▲◇

3 討 論 目前臨床上尚無(wú)明確有效的抗腎纖維化藥物，作為適合中國(guó)國(guó)情的中醫(yī)中藥，對(duì)其治療可能更有臨床應(yīng)用潛力。苦參系藥用豆科槐屬植物苦參（Sophora flavescens Ait）的干燥根，性寒味苦，始載于我國(guó)最早的藥學(xué)文獻(xiàn)《神農(nóng)本草經(jīng)》。隨著分離提取技術(shù)的進(jìn)步，發(fā)現(xiàn)在苦參、苦豆子、廣豆根中存在同一類以苦參堿（matrine，Ma）及氧化苦參堿（oxymatrine，OM）為代表的生物堿。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)OM具有抗器官纖維化的作用，目前臨床已應(yīng)用于病毒性肝炎、變態(tài)反應(yīng)性疾病、細(xì)菌感染等。因此我們決定研究OM對(duì)大鼠慢性腎纖維化的防治作用。NF-κB主要由P50和P65兩個(gè)亞基組成，在細(xì)胞靜息狀態(tài)下，NF-κB與其抑制因子IκB結(jié)合，形成 NF-κB／IκB復(fù)合體，使NF－κB以無(wú)活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞受到刺激后，IκB發(fā)生快速泛蛋白化及蛋白酶解，NF-κB被活化，異位到核，并與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域κB基序結(jié)合，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白合成[9]。許多免疫相關(guān)因子都含有NF－κB的結(jié)合序列位點(diǎn)，使NF-κB通過(guò)調(diào)節(jié)一系列重要的免疫因子的表達(dá)而參與對(duì)腎的損害過(guò)程。近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)部分藥物通過(guò)作用于IκB而發(fā)揮藥效，如糖皮質(zhì)激素可誘導(dǎo)IκBα的轉(zhuǎn)錄活性；免疫抑制劑可抑制IκB的降解，從而使IκB表達(dá)增多以降低NF-κB的表達(dá)[10]。本實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果證實(shí)：OM除了能抑制阿霉素大鼠腎臟纖維化組織中NF-κB蛋白的表達(dá)外，也能增強(qiáng)腎臟纖維化組織中IκB蛋白的表達(dá)。

眾所周知，AngⅡ作為一個(gè)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，能促進(jìn)多種細(xì)胞生成因子的釋放，如NF-κB。已有研究證實(shí)AngⅡ能增強(qiáng)腎小球系膜中NF－κB的結(jié)合活性[11]。因此AngⅡ可能通過(guò)增強(qiáng)NF-κB的活性而發(fā)揮致纖維化作用。從本實(shí)驗(yàn)可得出作為對(duì)腎臟纖維化有肯定療效的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ACEI）苯鈉普利，除了可以減緩腎臟纖維化的進(jìn)展外，還可下調(diào)NF-κB的表達(dá)和上調(diào)IκBα的表達(dá)，其中機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。在本實(shí)驗(yàn)研究中還發(fā)現(xiàn)OM100mg／kg·d對(duì)阿霉素大鼠腎纖維化的抑制作用強(qiáng)于 OM50mg／kg·d，并呈劑量依賴性，OM100mg／kg·d抑制腎纖維化的作用與苯鈉普利相比差異無(wú)顯著性，證明OM在抑制腎纖維化上可達(dá)到與ACEI同樣的效果。之后還有待于增加更多OM濃度組進(jìn)一步研究，為OM早日在臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

綜上所述，NF-κB的激活可能是腎臟纖維化發(fā)生發(fā)展的一個(gè)中心環(huán)節(jié)。并且其活性可被藥物控制。由此推論氧化苦參堿防治慢性腎纖維化機(jī)理為：通過(guò)對(duì)NF-κB／IκB信號(hào)傳導(dǎo)通路中，NF-κB的抑制作用及上調(diào)IκBα的表達(dá)和抑制其降解的作用，從而減少炎癥性細(xì)胞因子、趨化因子和促纖維化因子的產(chǎn)生，減少ECM的合成及沉積，最終起到有效地抗腎纖維化的目的。

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