二根龍蛭湯對腦缺血模型大鼠神經(jīng)細胞凋亡的影響＊

范小璇 頓寶生 強選平 趙曉平 逯 莉 陜西中醫(yī)學院附屬醫(yī)院外四科（咸陽 712000）

腦缺血發(fā)生后，常常導致患者學習記憶、肢體、語言等功能障礙，這些功能障礙的出現(xiàn)都是神經(jīng)元損害的結(jié)果。神經(jīng)元對缺血性損害的敏感性不一，凋亡與壞死并存，凋亡主要出現(xiàn)在缺血半暗帶，是遲發(fā)型神經(jīng)元損害的主要形式[1]。二根龍蛭湯是我們臨床總結(jié)的經(jīng)驗方，對缺血性中風等疾病治療效果明顯，為了揭示其作用機制，進行了本項研究，現(xiàn)匯報如下。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 選用SD成年大鼠40只，體重200±50g，雌雄各半（由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供，合格證號SCXK 2012-003）。隨機分為假手術(shù)組、模型組、對照組和治療組，每組10只。對照組給予吡拉西坦片灌胃，治療組給予二根龍蛭湯（葛根、白茅根、地龍、水蛭、丹參、紅花、川芎）灌胃治療。

1.2 造 模 參考文獻[2－3]制作腦缺血模型。所有動物購回后適應性喂養(yǎng)7d，術(shù)前12h禁飲食，自由飲水。稱重后用10%水合氯醛（3.5mL／kg）腹腔注射對大鼠麻醉，麻醉成功后將大鼠固定在鼠板上，頸部剃毛、皮膚消毒后，取正中切口，仔細分離右側(cè)頸外動脈、頸內(nèi)動脈，用絲線結(jié)扎頸外動脈，頸內(nèi)動脈遠端放置動脈夾；將頭皮針端口打磨光滑，把頭端涂有石蠟油的尼龍漁線從頸外動脈靠近分叉處導入血管內(nèi)，去掉動脈夾，在直視下緩慢推進漁線入顱，遇到阻力后停止，入顱約1.8cm；將頸內(nèi)動脈連同漁線一起結(jié)扎，放開頸外動脈結(jié)扎線，縫合皮膚。假手術(shù)組只切開頸部皮膚、暴露血管后縫合皮膚。

1.3 治 療 所有動物術(shù)后給予紅霉素軟膏涂抹傷口，假手術(shù)組和模型組術(shù)后6h開始給予進食進水，對照組術(shù)后6h給予進食水的基礎(chǔ)上吡拉西坦片（由宜昌人福藥業(yè)有限責任公司生產(chǎn)，按人與實驗用鼠比為1∶10進行換算后以3.6g／Kg·d劑量灌胃）灌胃進行治療，治療組術(shù)后6h給予進食水的基礎(chǔ)上給予二根龍蛭湯（由陜西國際商貿(mào)學院醫(yī)藥學院實驗室提供，根據(jù)體重按人正常用量的10倍）濃縮煎劑灌胃治療。

1.4 Morris水迷宮實驗 大鼠購回后第3d開始進行水迷宮訓練，連續(xù)3d，術(shù)后第4d再次進行訓練3d，第7d進行水迷宮實驗。放置一直徑1.3m、深0.5m的圓形水池，池壁為白色，標明Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個象限，在任何一象限內(nèi)放置一個直徑10cm、高25cm的安全平臺，水面沒過平臺5cm，水中注入適量奶粉，以目視看不見平臺為宜，水溫控制在25℃左右。記錄大鼠尋找到安全平臺時間，即逃避潛伏時間；再撤去平臺，選第Ⅱ象限入水點將大鼠面向池壁放入水中，記錄90s內(nèi)大鼠跨越原平臺次數(shù)。

1.5 指標測定 第7d水迷宮實驗結(jié)束后10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，開胸經(jīng)左心室穿刺，生理鹽水沖洗灌洗，見肝臟顏色發(fā)白后4%甲醛灌注固定，開顱取腦，冠狀面冰凍后切片，片厚6um。按照Bax、Bcl-2免疫組化試劑盒說明步驟進行。在40倍顯微鏡下觀察陽性標記物標記細胞的數(shù)量，進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果 本組實驗過程中，共死亡大鼠4只，其中模型組2只，治療組和對照組各1只。治療后第7d水迷宮實驗結(jié)果見表1，Bax和Bcl-2實驗結(jié)果見表2。

表1 治療后7d水迷宮實驗結(jié)果比較

表2 治療后7dBax、Bcl-2結(jié)果比較

3 討 論 腦缺血屬于中醫(yī)“中風”的范疇，《素問·風論》云：“風者，百病之始也?！闭撔皩嵍酗L。清·喻昌在《尚論后篇·真中》云：“中風之風乃人身自有之風，平素蘊蓄，而一旦內(nèi)出者也?！薄把觥睘橹酗L的病機關(guān)鍵，補陽還五湯用于治療中風病的臨床療效被廣泛認可，故而，活血化瘀治療成為治療的主要大法。經(jīng)驗方二根龍蛭湯由葛根、白茅根、地龍、水蛭、丹參、紅花、川芎七味藥組成。水蛭、地龍共為君藥，水蛭咸、苦、平而歸肝經(jīng)，破血、逐瘀、通經(jīng)，地龍咸、寒歸肝、脾膀胱經(jīng)，息風通絡、利水，二藥共用使瘀血消散，閉阻之經(jīng)絡暢通；臣以丹參、紅花、川芎，丹參苦、寒，歸心、肝經(jīng)，具有活血調(diào)經(jīng)、涼血安神之功效，紅花心溫，歸心、肝經(jīng)，具有活血通經(jīng)、祛瘀止痛之功效，二者相須為用，功專于化瘀，再加活血行氣、祛風止痛之川芎，能上行頭目，旁通絡脈，使瘀血去、經(jīng)脈通，頭痛止，意識清；佐以葛根，甘辛涼，解肌退熱，擴管通脈，使藥白茅根甘、寒，涼血止血，清熱利水，使熱散而血止，濕滲則水利；全方共奏化瘀通絡利水之效。

本項研究結(jié)果顯示，模型組大鼠逃避潛伏期時間較假手術(shù)組明顯延長，說明造模成功，二根龍蛭湯治療后，腦缺血大鼠逃避潛伏期較模型組縮短，跨越平臺次數(shù)增加，說明二根龍蛭湯有改善腦缺血大鼠學習記憶功能的作用。研究表明，Bcl-2具有明顯的抗細胞凋亡和延長細胞壽命的作用[4]，Bcl-2蛋白家族是細胞凋亡調(diào)控蛋白，Bcl-2／Bax基因是目前研究較為明確的一對在功能上相互對立的凋亡調(diào)控基因[5]。本研究表明，二根龍蛭湯能抑制腦缺血模型大鼠Bax的升高，促進Bcl-2的升高，說明二根龍蛭湯能減輕腦缺血大鼠神經(jīng)細胞的凋亡，從而減輕神經(jīng)功能的損害。

總之，二根龍蛭湯對腦缺血大鼠學習記憶能力具有明顯的改善作用，可能是通過減輕神經(jīng)細胞凋亡的作用來實現(xiàn)的。

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