不同時機(jī)針刺介入對TBI模型大鼠NGF蛋白表達(dá)及mRNA水平調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究＊

郭新榮 王瑞輝 吳 濤 史海龍 屈紅艷 陜西中醫(yī)學(xué)院（咸陽 712046）

NGF（nerve growth factor，NGF）是最早發(fā)現(xiàn)的典型的神經(jīng)營養(yǎng)因子、研究最為廣泛、最深入，其在神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育、軸突的生長及遞質(zhì)的合成和細(xì)胞的凋亡等多個環(huán)節(jié)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[1]。NGF能促進(jìn)外周及中樞神經(jīng)元的分化、生長和存活，在維持大腦正常的生理功能中發(fā)揮著極其重要的調(diào)節(jié)作用[2]。本研究旨在觀察針刺不同時間干預(yù)治療TBI的效果，選用NGF作為觀察指標(biāo)。

1 材料及方法

1.1 動物及分組 實(shí)驗(yàn)大鼠（批號：20121023）由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，體重220～240g，適應(yīng)性飼養(yǎng)3d，隨機(jī)分為空白（A）、針刺1（B）、針刺2（C）、針刺3（D）和模型（E）組。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備及試劑 全自動脫水機(jī)（ZT-12J）、切片機(jī)（JJQ-P2016J，均湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；包埋機(jī)（JB-L6，武漢俊杰電子有限公司）；冷凍高速離心機(jī)（德國eppendorf centrifuge 5417R）；PH酸度計(jì)德國（（Sartorius PB-10），賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；微型脫色搖床（TY-80S型，南京新校園生物技術(shù)研究所）；電泳槽（美國 BIO-RAD；轉(zhuǎn)印槽（美國BIO-RADMini Trans-Blot?Cell）；NanoDrop微量核酸定量儀（Thermo Fisher Scientific，Inc）；熒光定量PCR設(shè)備（美國伯樂IQ5）。

TransScript All-in-One First-Strand Cdna Synthesis Super Mix for qPCR試劑盒、TransStar Top Green qPCR SuperMix試劑盒（均北京全式生物技術(shù)有限公司）引物合成（由南京金斯瑞生物科技有限公司提供）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（北京諾博萊德科技有限公司）；Blue Plus II Protein Marker（14KDa-100KDa）、Anti-β-actin Mouse Monoclonal Antibody、Goat Anti-Rabbit IgG（H＋L），HRP Conjugate、Goat Anti-Mouse IgG（H＋L），HRP Conjugate（均北京全式生物技術(shù)有限公司）；NGF beta Rabbit Monoclonal Antibody（美國 EPITMICS公司）；ECL Plus熒光檢測試劑盒（MILLIPORE）；Rabbit Anti-NGF一抗、兔源二抗IgG－兔免疫組化試劑盒SABC即用型、DAB顯色試劑盒（均武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 TBI模型制備 術(shù)前禁食8h。實(shí)驗(yàn)時腹腔內(nèi)注射2%的戊巴比妥鈉（75mg／kg）進(jìn)行麻醉，俯臥位固定于腦立體定向儀上。消毒皮膚，正中切開，剝離骨膜 ，暴露右頂骨，用微型磨鉆在冠狀縫后3mm、中線右旁2.5mm處鉆一直徑為2mm的骨窗，保持硬膜完整。將大鼠移置到電子顱腦損傷儀（eCCI-6.3，美國VCU大學(xué)設(shè)計(jì)）操作臺上，調(diào)試好機(jī)器參數(shù)（打擊速度4m／s、深度3mm），對B、C、D和E組動物全部進(jìn)行打擊，撞擊桿撞擊硬膜，使腦組織產(chǎn)生瞬間形變。打擊后向切口內(nèi)滴注4萬單位硫酸慶大霉素4～5滴 ，骨蠟封閉骨窗 ?？p合頭皮，外涂抹紅霉素軟膏。造模后，放回籠中，單獨(dú)喂養(yǎng)。

1.4 治療方法 取穴“百會”、“人中”、左側(cè)“內(nèi)關(guān)”、“足三里”[3]。定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》并結(jié)合人體同身寸取穴法?？瞻捉M、模型組，正常飼養(yǎng)；B、C、D組分別于造模后第1、3、5d開始針刺治療，1d1次，連續(xù)10次。操作方法：75%乙醇棉球穴位消毒，選28號0.5寸華佗牌毫針、常規(guī)消毒，百會向前斜刺、人中直刺，內(nèi)關(guān)、足三里直刺，刺入深度均為2～3mm，各穴均行捻轉(zhuǎn)手法，前后捻轉(zhuǎn)各360°左右為1次，共捻轉(zhuǎn)30次啟針。

1.5 實(shí)驗(yàn)檢測 所有動物于造模后第15d取材，分別進(jìn)行以下檢測：免疫組化：標(biāo)本經(jīng)固定后制成4um厚的石蠟切片，采用SABC染色法。光學(xué)顯微鏡下觀察切片中組織染色機(jī)NGF蛋白表達(dá)情況。

Western blot法檢測NGF蛋白含量：取損傷腦組織，過液氮，用高效RIPA提取蛋白、BCA進(jìn)行蛋白定量。使用5×SDS上樣緩沖液煮沸5min制備10ug／ul樣本，冷卻到室溫，12000轉(zhuǎn)／分的低溫高速離心機(jī)離心5min，取上清4℃冰箱保存供電泳使用；使用12%的分離膠10mL、5%的濃縮膠5mL灌膠，上樣10ul；60V低電壓跑約30min，、90V電泳跑約90min進(jìn)行電泳；轉(zhuǎn)膜（400mA，2.0h）；5%milk脫色搖床上搖60min；孵一抗冰箱過夜（1：3000）；TBST10min×2次、TBS5min×1次，孵二抗（1：5000，常溫3～5h；TBST10min×2次、TBS5min×1次；ECL發(fā)光，5S～45S；X線壓片、顯影、定影。以β-actin作為內(nèi)參。

定量PCR檢測mRNA含量：取損傷腦組織，過液氮，用Trizol試劑提取總RNA；使用NANO核酸核糖測定儀測定所提取的RNA的濃度，調(diào)整RNA的濃度到10ug／ul；反轉(zhuǎn)錄為DNA（按試劑盒說明操作）；利用NANO測定DNA純度、濃度，調(diào)整DNA濃度為20ng／ul；熒光定量PCR反應(yīng)（參考試劑盒說明操作），NGF上游引物：5’＞CTTCAGCATTCCCTTGACAC＜3’、下游引物：5’＞AAGCCTTCCTGCTGAGCACACA＜3’，β-actin上游引物：5’＞TCATGAAGTGTGACGTGGACATC＜3’，下游引物：5’＞TGTTGCATTTGCGGGGACGATG＜3’，循環(huán)參數(shù)：95℃5min預(yù)熱，95℃10S、30℃30S、72℃30S共循環(huán)共40次，72℃5min，55℃30S、溫度梯度為0.5℃，溶解曲線（Melt crave）共81各循環(huán)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化 免疫組化圖片采用陜西中醫(yī)學(xué)院分子生物與免疫組化實(shí)驗(yàn)中心Motic images Advanced 3.0圖像分析系統(tǒng)，檢測NGF陽性表達(dá)物情況，在400倍光鏡下隨機(jī)選擇5個相鄰視野，計(jì)算陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)，取5個視野的平均值。

表1 SD大鼠腦皮層NGF蛋白表達(dá)的比較（）

表1 SD大鼠腦皮層NGF蛋白表達(dá)的比較（）

注：△與空白組比較P＜0.01，▲與模型對照組比較P＜0.01，◇與針刺1組比較P＜0.01，◆與針刺2組比較P＜0.01。下同

組 別 n 8 39.78±10.27針刺1組 8 58.78±12.54▲針刺2組 8 53.43±8.11▲◇針刺3組 8 49.28±9.91▲◇◆模型組 8 30.83±11.31陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)空白組△

圖1 各組SD大鼠腦皮層NGF蛋白表達(dá)（×200）

2.2 Western-blot法結(jié)果 X-RAY圖像結(jié)果利用掃描儀掃描成圖片，再利用Kodak Digital Science 1D軟件分別計(jì)算NGF和β-actin各條帶的灰度和面積之乘積，最后分別計(jì)算出NG與β-actin的比值，即得到各蛋白表達(dá)的相對百分含量。各組結(jié)果利用（）表示。

表2 SD大鼠腦皮層NGF蛋白WB檢測灰度值比較（）

表2 SD大鼠腦皮層NGF蛋白WB檢測灰度值比較（）

組 別 n 8 7.06±1.28針刺1組 8 14.98±0.85▲針刺2組 8 13.55±1.43▲◇針刺3組 8 12.22±1.04▲◇◆模型組 8 5.55±1.23灰度值空白組△

圖2 腦組織皮質(zhì)區(qū)NGF蛋白含量的表達(dá)

2.3 熒光定量PCR結(jié)果 以β-actin的循環(huán)閾值（threshold cycle，CT值定義為每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）作為內(nèi)參，計(jì)算目標(biāo)基因與內(nèi)參的差值ΔCT（ΔCT＝β-actinCT-target gene CT），數(shù)據(jù)采用2－ΔCT法計(jì)算出mRNA的水平。

表3 腦皮質(zhì) NGFmRNA含量的比較（2－ΔCT，）

表3 腦皮質(zhì) NGFmRNA含量的比較（2－ΔCT，）

組 別 n 2－ΔCT 6 0.022±0.012針刺1組 6 0.292±0.032▲針刺2組 6 0.175±0.023▲◇針刺3組 6 0.049±0.008▲◇◆模型組 6 0.016±0.010空白組△

3 討 論 中醫(yī)認(rèn)為，TBI病位在腦，病機(jī)為氣滯、瘀血、痰濕阻滯經(jīng)絡(luò)導(dǎo)致清竅阻蔽，或者氣機(jī)逆亂。故治療原則采用活血化瘀、化痰開竅、疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)理氣機(jī)。我們文獻(xiàn)研究結(jié)果[3]顯示，針灸治療TBI多選督脈、手足陽明經(jīng)腧穴。其一，督脈與腦有著密切的關(guān)系，《難經(jīng)》有：“督脈者，起于下極之俞，并于脊里，上至風(fēng)府，入屬于腦”的記述，并多次與手足三陽經(jīng)及陽維脈交會。其二，從功能上看，督脈有“總督諸陽”之功，為“陽脈之?！保{(diào)節(jié)全身陽經(jīng)，且對整個經(jīng)脈系統(tǒng)有統(tǒng)帥作用。其三，現(xiàn)代研究也認(rèn)為督脈位居身體的中軸線上，通過雙側(cè)神經(jīng)調(diào)節(jié)，能起到促進(jìn)腦功能的代償和重組作用。陽明經(jīng)脈多氣多血，TBI因氣滯、氣亂、血瘀造成，故多用陽明經(jīng)上的穴位來活血化瘀、行氣通經(jīng)。

本研究中，選用的腧穴為百會、人中、內(nèi)關(guān)和足三里。百會為“三陽五會”，穴居巔頂，屬督脈通于腦，具有醒腦安神、升清化濁的作用。針刺督脈百會穴，可以改善大鼠自由基代謝，促進(jìn)受損神經(jīng)元修復(fù)，提高其學(xué)習(xí)記憶能力的作用，同時能減輕腦水腫，有助于瘀血的消散吸收，對腦缺血及再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。另外，有研究認(rèn)為百會位于大腦的前動脈主干投影區(qū)，也為皮層運(yùn)動、感覺區(qū)上部的投影區(qū)，針刺百會對改善大腦的前動脈血液循環(huán)，興奮皮層運(yùn)動區(qū)，感覺區(qū)有重要意義。人中為督脈經(jīng)與手陽明大腸經(jīng)及足陽明胃經(jīng)之交會穴，有清熱開竅，鎮(zhèn)痛寧神，回陽救逆，祛風(fēng)止痛之功?，F(xiàn)代研究表明，針刺人中能興奮腦神經(jīng)元、整合復(fù)雜的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、促進(jìn)腦組織血液循環(huán)，增加腦灌注量。實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)人中對腦損傷后意識障礙及腦電圖的改善優(yōu)于其他穴位。足三里為足陽明胃經(jīng)穴位，選其以扶正，補(bǔ)后天氣血生化之源以治本，調(diào)和經(jīng)脈，疏通氣血?？傊?，諸穴合用，可以達(dá)到醒腦開竅、通經(jīng)活絡(luò)、調(diào)整氣機(jī)之效，促進(jìn)TBI損傷腦組織的恢復(fù)。

Lee的實(shí)驗(yàn)表明[4]NGF與許多中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)病變密切相關(guān)，在學(xué)習(xí)、記憶、神經(jīng)細(xì)胞損傷后的恢復(fù)中起重要的調(diào)節(jié)作用。Dekosky[5]等研究發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷性腦損傷中NGF蛋白在大腦皮質(zhì)明顯增加，其mRNA于傷后1d增加5倍，認(rèn)為NGF在神經(jīng)損害后神經(jīng)再生和修復(fù)中起保護(hù)作用。本研究在不同時間開始針刺治療TBI的時效作用的實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果免疫組化和Western-blot法檢測均發(fā)現(xiàn)模型組對照組動物腦組織皮層NGF表達(dá)略有降低，同空白組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這可能由于損傷時間較長，在病理情況下升高的NGF沒有得到即時的治療維持、很快的消耗導(dǎo)致，針刺組腦組織中NGF含量均明顯高于空白組、模型組，表明針刺對腦組織中NGF的含量確有上調(diào)作用。進(jìn)一步，我們運(yùn)用熒光定量PCR觀測其相應(yīng)mRNA表達(dá)的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)針刺對NGFmRNF的表達(dá)的調(diào)控作用也同樣如此。且針刺1組優(yōu)于針刺2組、針刺3組，針刺2組優(yōu)于針刺3組，且組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。表明針刺介入治療TBI的時間可能越早越有利于發(fā)揮針刺上調(diào)腦組織神經(jīng)元的神經(jīng)生長因子NGF及相應(yīng)mRNA表達(dá)，達(dá)到保護(hù)腦組織神經(jīng)元的作用。

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