miR-483-3p對結(jié)直腸癌DLC1基因表達的影響*

蔣菁蕊 劉 媛 吳少亙 曹望森 崔恒宓,3# 于成功#

南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院消化科1(210008) 南京大學醫(yī)學院2 揚州大學表觀遺傳學及表觀基因組學研究所3

Cell Proliferation

結(jié)直腸癌是常見且多發(fā)的消化道惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈上升趨勢。抑癌基因表達抑制在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，是結(jié)直腸癌的發(fā)病機制之一。肝癌缺失基因1(deleted in liver cancer 1, DLC1)于1998年首次被發(fā)現(xiàn)，該基因定位于8p21.3-22，編碼1 091個氨基酸，與鼠源p122 Rho GAP有86%的同源性，在多種實體腫瘤中低表達或完全沉默[1-3]。Zhou等[4]的研究顯示，DLC1可抑制腫瘤細胞生長，誘導細胞凋亡，并通過調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架結(jié)構(gòu)和黏著斑影響細胞遷移。已知一些microRNAs可通過調(diào)節(jié)抑癌基因的表達影響腫瘤發(fā)生。miR-483位于腫瘤相關(guān)基因胰島素樣生長因子2(IGF2)的第7號內(nèi)含子內(nèi)，其前體發(fā)夾結(jié)構(gòu)有2個亞單位，即3’端的miR-483-3p和5’端的miR-483-5p，研究[5]發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中的miR-483-3p表達水平明顯高于正常結(jié)直腸組織。根據(jù)Targetscan數(shù)據(jù)庫預測，miR-483-3p可與DLC1 3’非翻譯區(qū)(3’UTR)的對應(yīng)序列靶向結(jié)合，可能通過降解DLC1 mRNA或抑制其翻譯而降低其蛋白水平，從而影響DLC1的抑癌作用。本研究通過檢測結(jié)直腸癌組織中的DLC1和miR-483-3p表達水平，并探討miR-483-3p對DLC1表達的靶向調(diào)節(jié)作用，以期闡明miR-483-3p在結(jié)直腸癌發(fā)生中的作用機制。

材料與方法

一、標本獲取

納入2012年10月～2013年4月南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院收治的結(jié)直腸癌患者16例，其中男7例，女9例，年齡45～84歲，平均(64.1±13.9)歲。采集癌組織及其相應(yīng)癌旁非癌組織(距癌組織邊緣4～5 cm)標本，所有標本均經(jīng)HE染色后由組織病理學檢查確診，病理類型均為腺癌，Dukes分期A期1例，B期2例，C期12例，D期1例。研究方案經(jīng)南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，入選患者均簽屬知情同意書。

二、細胞株和主要試劑

人結(jié)腸癌細胞株HCT116、人胚腎細胞株HEK293T(南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院消化科實驗室保存)。鼠抗人DLC1單克隆抗體(美國BD公司)，羊抗鼠IgG-HRP[生興生物技術(shù)(南京)有限公司]，Trizol試劑、microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taqman探針試劑盒、Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑盒(美國Invitrogen 公司)，q-PCR Mix(美國ABI公司)，pmirGLO雙熒光素酶報告基因載體(美國Promega公司)，限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、XbaⅠ(美國Fermentas公司)，miR-483-3p mimic、陰性對照mimic(廣州銳博生物科技有限公司)，CCK-8試劑盒(日本同仁化學研究所)。

三、方法

1. 蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)直腸癌組織和癌旁非癌組織DLC1表達：取癌組織和癌旁非癌組織，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白含量。每一樣本取100 μg總蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入鼠抗人DLC1單克隆抗體(1∶200) 4 ℃過夜，加入羊抗鼠IgG HRP(1∶5 000)室溫孵育1 h，ECL顯影，定影，凝膠成像系統(tǒng)拍照、分析。

2. qRT-PCR檢測結(jié)直腸癌組織和癌旁非癌組織miR-483-3p表達：取癌組織和癌旁非癌組織，以Trizol試劑提取總RNA，參照microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：16 ℃ 30 min； 42 ℃ 30 min；85 ℃ 5 min；4 ℃控溫。q-PCR反應(yīng)采用Taqman探針法，選用U6作為內(nèi)參照，反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。2-ΔΔCt法計算miR-483-3p相對表達量。

3. pmirGLO-DLC1 WT和pmirGLO-DLC1 MUT載體構(gòu)建：在Targetscan數(shù)據(jù)庫中查找得到DLC1 3’UTR序列中與miR-483-3p互補的種子序列為AGGAGTG，以NCBI數(shù)據(jù)庫中查找得到的DLC1(Gene ID：10395) 3’UTR序列為模板設(shè)計引物，上游引物：5’-CCG CTC GAG GCT TCC TGT TTG TTG AGG GTC T-3’(劃線處為XhoⅠ酶切位點)，下游引物：5’-CTA GTC TAG AAA GGC TAG AGG GAG CAG TTC AT-3’(劃線處為XbaⅠ酶切位點)。PCR擴增片段長度為677 bp，包含miR-483-3p靶位序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)XhoⅠ和XbaⅠ酶切后，與同樣經(jīng)酶切的pmirGLO載體進行連接，所構(gòu)建的野生型載體命名為pmirGLO-DLC1 WT。設(shè)計種子序列的突變序列為AGGCTGG(劃線處為突變后堿基)，采用重疊延伸PCR法誘導定點突變，突變型上游引物：5’-TGC ACA GAG GCT GGT GAA TGT G-3’，下游引物：5’-ACA CAT TCA CCA GCC TCT GTG C-3’，酶切和連接方法同野生型載體，所構(gòu)建的突變型載體命名為pmirGLO-DLC1 MUT。以上引物合成和載體測序鑒定均由上海桑尼生物技術(shù)公司完成。

4. 熒光素酶報告基因檢測實驗：HCT116細胞以含10%胎牛血清的McCoy’s 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜貼壁，制成細胞懸液，調(diào)整密度為2×105/mL，以每孔1 mL接種于12孔板，待細胞密度至70%，參照Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行操作，分別將pmirGLO-DLC1 WT或pmirGLO-DLC1 MUT與miR-483-3p mimic或陰性對照mimic共轉(zhuǎn)染HCT116細胞，報告基因質(zhì)粒為200 ng/孔，核酸濃度為50 nmol/L，5 h后棄轉(zhuǎn)染液，更換為新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進行細胞裂解，提取細胞裂解液。取熒光素酶報告分析儀專用檢測板，每孔加入10 μL熒光素酶催化底物與10 μL細胞裂解液混勻，Promega熒光測定儀測定熒光素酶活性。每組設(shè)3個復孔，實驗重復3次。對螢火蟲熒光素酶熒光值與海腎熒光素酶熒光值的比值進行校正，作為各孔報告基因熒光強度值。

5. 蛋白質(zhì)印跡法檢測miR-483-3p對HEK293T細胞DLC1表達的影響：HEK293T細胞經(jīng)胰酶消化后制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度，接種至6孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜貼壁，分別以50、100 nmol/L miR-483-3p mimic或陰性對照mimic轉(zhuǎn)染細胞48 h、60 h，蛋白質(zhì)印跡法檢測同步驟1。

6. CCK-8實驗檢測miR-483-3p對HCT116細胞增殖的影響：取對數(shù)生長期HCT116細胞制成單細胞懸液，以1×104/孔接種至96孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜貼壁，分別以50、100 nmol/L miR-483-3p mimic或陰性對照mimic轉(zhuǎn)染細胞 24 h、 48 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑，酶標儀測定450 nm 波長處吸光度(A)值。每組設(shè)5個復孔，實驗重復3次。

四、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、結(jié)直腸癌組織、癌旁非癌組織DLC1表達

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，16例結(jié)直腸癌患者中10例(62.5%)癌組織DLC1表達水平顯著低于癌旁非癌組織(見圖1)。

1 Da=0.992 1 u

圖1結(jié)直腸癌組織、癌旁非癌組織DLC1表達(蛋白質(zhì)印跡法)

二、結(jié)直腸癌組織、癌旁非癌組織miR-483-3p表達

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，16例結(jié)直腸癌患者癌組織中的miR-483-3p表達水平均不同程度地高于癌旁非癌組織，10例DLC1低表達者癌組織與癌旁非癌組織相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖2)。

圖210例DLC1低表達結(jié)直腸癌患者癌組織、癌旁非癌組織miR-483-3p表達

三、miR-483-3p靶向調(diào)控DLC1表達

熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，pmirGLO-DLC1 WT與miR-483-3p mimic共轉(zhuǎn)染HCT116細胞后，熒光素酶活性較pmirGLO-DLC1 WT與陰性對照mimic共轉(zhuǎn)染顯著降低(P<0.01)；而pmirGLO-DLC1 MUT與miR-483-3p mimic共轉(zhuǎn)染HCT116細胞后，熒光素酶活性與pmirGLO-DLC1 MUT與陰性對照mimic共轉(zhuǎn)染相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見圖3)，證實DLC1是由miR-483-3p調(diào)控的靶基因。

四、miR-483-3p對HEK293T細胞DLC1表達的影響

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，50、100 nmol/L miR-483-3p mimic轉(zhuǎn)染內(nèi)源性DLC1表達水平較高的HEK293T細胞48 h后，DLC1表達水平與陰性對照組相比無明顯差異；轉(zhuǎn)染60 h后，100 nmol/L miR-483-3p mimic組DLC1表達水平較陰性對照組顯著降低，50 nmol/L組與陰性對照組間則無明顯差異(見圖4)。

A：pmirGLO-DLC1 WT與陰性對照mimic共轉(zhuǎn)染；B：pmirGLO-DLC1 WT與miR-483-3p mimic共轉(zhuǎn)染；C：pmirGLO-DLC1 MUT與陰性對照mimic共轉(zhuǎn)染；D：pmirGLO-DLC1 MUT與miR-483-3p mimic共轉(zhuǎn)染

圖3miR-483-3p靶向調(diào)控DLC1表達

1：陰性對照mimic；2：miR-483-3p mimic

圖4miR-483-3p對HEK293T細胞DLC1表達的影響(蛋白質(zhì)印跡法)

五、miR-483-3p對HCT116細胞增殖的影響

CCK-8實驗結(jié)果顯示，50、100 nmol/L miR-483-3p mimic轉(zhuǎn)染HCT116細胞24 h后，細胞增殖能力與陰性對照組相比無明顯變化(P>0.05)；轉(zhuǎn)染48 h 后，50、100 nmol/L miR-483-3p mimic組細胞增殖能力均較陰性對照組顯著增強(P<0.05)(見圖5)，但兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

A: 50 nmol/L 轉(zhuǎn)染濃度；B: 100 nmol/L 轉(zhuǎn)染濃度

圖5miR-483-3p對HCT116細胞增殖的影響(轉(zhuǎn)染48h)

討 論

DLC1是一種重要的抑癌基因，目前已在多種惡性腫瘤如肝癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌中發(fā)現(xiàn)DLC1表達降低或缺失，結(jié)直腸癌患者中約43%存在DLC1表達降低或缺失[6]。DLC1可通過自身多個結(jié)構(gòu)域如Rho GAP、START、SAM發(fā)揮抑癌作用[7]，其中Rho GAP結(jié)構(gòu)域的抑癌作用受到較多關(guān)注，其可通過調(diào)節(jié)Rho蛋白RhoA、RhoC、Cdc42三個亞型的表達，影響細胞增殖、凋亡和遷移[8]。本研究結(jié)果顯示，62.5%的結(jié)直腸癌患者癌組織DLC1表達水平較癌旁非癌組織顯著降低，與上述研究結(jié)果相符。然而本研究樣本量較小，未能進一步按病理分期分組，分析DLC1表達與結(jié)直腸癌病理分期的關(guān)系，有待后續(xù)擴大樣本量作進一步研究。

表觀遺傳學調(diào)節(jié)異常在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中，尤其是抑癌基因的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，對DLC1表達的相關(guān)調(diào)節(jié)機制包括啟動子甲基化、組蛋白去乙?；约癿icroRNAs的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)[9-10]。microRNAs對基因表達的調(diào)節(jié)作用主要是抑制靶基因mRNA翻譯或降解靶mRNA，從而降低靶基因蛋白水平。IGF2是較早發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性印跡基因，其缺失可導致結(jié)直腸癌等多種腫瘤發(fā)生[11]。miR-483-3p位于IGF2基因內(nèi)含子內(nèi)，兩者表達水平呈正相關(guān)，提示miR-483-3p可能作用于抑癌基因，促進腫瘤發(fā)生[5]。本研究通過熒光素酶報告基因檢測實驗證實，DLC1為miR-483-3p的靶基因，miR-483-3p可靶向結(jié)合DLC1的種子序列而抑制其表達，導致蛋白水平降低。為驗證miR-483-3p對DLC1表達的影響，本研究進一步以miR-483-3p mimic轉(zhuǎn)染DLC1表達水平較高的HEK293T細胞并檢測細胞內(nèi)DLC1表達情況，結(jié)果顯示較高濃度(100 nmol/L)、較長時間(60 h)轉(zhuǎn)染miR-483-3p mimic可顯著抑制DLC1表達，進一步證實DLC1是miR-483-3p的靶基因。此外，CCK-8實驗結(jié)果顯示，miR-483-3p mimic較長時間(48 h)轉(zhuǎn)染HCT116細胞后，細胞增殖能力顯著增強，提示miR-483-3p抑制DLC1表達對結(jié)直腸癌的發(fā)生具有促進作用。

綜上所述，本研究通過蛋白質(zhì)印跡法和qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織DLC1表達水平降低， miR-483-3p表達水平增高；進一步的熒光素酶報告基因檢測實驗發(fā)現(xiàn)miR-483-3p可直接與DLC1的3’UTR結(jié)合而抑制其表達，進而促進結(jié)腸癌細胞增殖，證實miR-483-3p可在轉(zhuǎn)錄后水平抑制DLC1表達，參與促進結(jié)直腸癌發(fā)生。本研究揭示了miR-483-3p在結(jié)直腸癌發(fā)生中的作用機制，然而miR-483-3p能否作為結(jié)直腸癌的治療靶點和發(fā)生風險評估指標，仍有待進一步研究。

1 Yuan BZ, Miller MJ, Keck CL, et al. Cloning, characterization, and chromosomal localization of a gene frequently deleted in human liver cancer (DLC-1) homologous to rat RhoGAP[J]. Cancer Res, 1998, 58 (10): 2196-2199.

2 Seng TJ, Low JS, Li H, et al. The major 8p22 tumor suppressor DLC1 is frequently silenced by methylation in both endemic and sporadic nasopharyngeal, esophageal, and cervical carcinomas, and inhibits tumor cell colony formation[J]. Oncogene, 2007, 26 (6): 934-944.

3 Ullmannova V, Popescu NC. Expression profile of the tumor suppressor genes DLC-1 and DLC-2 in solid tumors[J]. Int J Oncol, 2006, 29 (5): 1127-1132.

4 Zhou X, Zimonjic DB, Park SW, et al. DLC1 suppresses distant dissemination of human hepatocellular carcinoma cells in nude mice through reduction of RhoA GTPase activity, actin cytoskeletal disruption and down-regulation of genes involved in metastasis[J]. Int J Oncol, 2008, 32 (6): 1285-1291.

5 Veronese A, Lupini L, Consiglio J, et al. Oncogenic role of miR-483-3p at the IGF2/483 locus[J]. Cancer Res, 2010, 70 (8): 3140-3149.

6 Liao YC, Lo SH. Deleted in liver cancer-1 (DLC-1): a tumor suppressor not just for liver[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2008, 40 (5): 843-847.

7 Lukasik D, Wilczek E, Wasiutynski A, et al. Deleted in liver cancer protein family in human malignancies (Review)[J]. Oncol Lett, 2011, 2 (5): 763-768.

8 Durkin ME, Yuan BZ, Zhou X, et al. DLC-1: a Rho GTPase-activating protein and tumour suppressor[J]. J Cell Mol Med, 2007, 11 (5): 1185-1207.

9 Banaudha K, Kaliszewski M, Korolnek T, et al. MicroRNA silencing of tumor suppressor DLC-1 promotes efficient hepatitis C virus replication in primary human hepatocytes[J]. Hepatology, 2011, 53 (1): 53-61.

10 Pacurari M, Addison JB, Bondalapati N, et al. The microRNA-200 family targets multiple non-small cell lung cancer prognostic markers in H1299 cells and BEAS-2B cells[J]. Int J Oncol, 2013, 43 (2): 548-560.

11 Cui H, Horon IL, Ohlsson R, et al. Loss of imprinting in normal tissue of colorectal cancer patients with microsatellite instability[J]. Nat Med, 1998, 4 (11): 1276-1280.