姜黃素對(duì)氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞單核細(xì)胞趨化蛋白—1表達(dá)、細(xì)胞增殖和凋亡的影響

李濤 馮愛(ài)橋

[摘要] 目的 探討姜黃素對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞單核細(xì)胞趨化蛋白-1表達(dá)、增殖和凋亡的影響。 方法 分離SD大鼠血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)傳代，采用不同濃度的姜黃素作用于氧化型低密度脂蛋白（Ox-LDL）誘導(dǎo)的大鼠平滑肌細(xì)胞，根據(jù)作用藥物濃度進(jìn)行分組，對(duì)照組（不加任何藥物），Ox-LDL 100 μg/mL組，Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素 20 μmol/L組，Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素 40 μmol/L組，Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素80 μmol/L組。分析姜黃素對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）的表達(dá)、對(duì)細(xì)胞的增殖的影響。按照加入藥物濃度進(jìn)行分組，對(duì)照組（不加任何藥物），姜黃素50 μmol/L組，姜黃素100 μmol/L組，姜黃素120 μmol/L組，分析姜黃素對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。 結(jié)果 Ox-LDL 100 μg/mL組MCP-1分泌[（812.6±78.7）ng/L]及MCP-1 mRNA表達(dá)水平[（1.18±0.11）]較對(duì)照組[（91.3±6.1）ng/L，（0.16±0.04）]顯著升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。姜黃素對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞MCP-1分泌及MCP-1 mRNA表達(dá)、細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用，對(duì)細(xì)胞凋亡有誘導(dǎo)作用，并且隨著姜黃素濃度的增加，作用越明顯（P < 0.01）。 結(jié)論 姜黃素能夠抑制Ox-LDL誘導(dǎo)的大鼠細(xì)胞平滑肌細(xì)胞MCP-1表達(dá)以及細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)大鼠細(xì)胞平滑肌細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞] 姜黃素；大鼠；血管平滑肌細(xì)胞；單核細(xì)胞趨化蛋白-1

[中圖分類號(hào)] R587.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）07（c）-0008-05

冠心病是臨床常見(jiàn)病，近年來(lái)，隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的變化以及生活工作節(jié)奏的增快，冠心病的發(fā)生率呈上升趨勢(shì)。動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病的病理基礎(chǔ)，而平滑肌增生、遷移參與了冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的整個(gè)過(guò)程。氧化型低密度脂蛋白（Ox-LDL）能夠促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展[1-2]。單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）具有活化和趨化單核/巨噬細(xì)胞的作用，單核細(xì)胞在MCP-1的趨化作用下，聚集在血管內(nèi)膜下，吞噬脂質(zhì)、形成泡沫細(xì)胞[3-4]。姜黃素是一種從姜黃、莪術(shù)等植物中提取的成分，具有抗炎、抗氧化、抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等作用[5]。本研究分析姜黃素對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)大鼠平滑肌細(xì)胞MCP-1的表達(dá)情況以及平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD雄性大鼠，體重250～300 g，周齡2～5周，購(gòu)于常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 姜黃素（長(zhǎng)沙華錦生物科技有限公司），大鼠MCP-1 ELISA試劑盒（上海凱博生化試劑有限公司），Western-blot化學(xué)發(fā)光試劑盒（貝博生物），總DNA提取盒（廣州健侖生物科技有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（廣州健侖生物科技有限公司），PCR擴(kuò)增試劑盒（上海生工生物科技有限公司）。二氧化碳培養(yǎng)箱（無(wú)錫精創(chuàng)科技有限公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（法國(guó)Vilber），低溫冷凍高速離心機(jī)（德國(guó)Hettich），蛋白電泳儀（日本ATTO株式會(huì)社公司），基因擴(kuò)增儀（上海西樸生物科技有限公司），多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）。

1.1.3 主要試劑配制 姜黃素溶液：姜黃素粉末溶于二甲基椏楓，配成的原液濃度為50 mmol/L，低溫保存，需要時(shí)配制成需要的濃度。PBS平衡鹽溶液配制：8 g氯化鈉，0.2 g氯化鉀，磷酸氫鈉2.9 g，磷酸氫鉀0.2 g加蒸餾水，陪成1 L，調(diào)整pH值7.3～7.5，分裝，低溫保存。培養(yǎng)基：DMEM干粉加去離子水溶解，定容1000 mL，加雙抗，調(diào)節(jié)pH為7.0，過(guò)濾除菌后分裝，4℃保存。MTT（噻唑藍(lán)）工作液：MTT溶于PBS液中，配制濃度為5 mg/mL，過(guò)濾除菌，4℃保存。

1.2 研究方法

1.2.1 大鼠原代主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)傳代 SD大鼠處死后分離大鼠主動(dòng)脈，在青霉素?zé)o血清DMEM中漂洗3～4次，分離中膜層，DMEM培養(yǎng)基清洗3次，放入培養(yǎng)皿，加胎牛血清。剪碎中膜層，放入培養(yǎng)瓶中，加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織塊貼壁，放入培養(yǎng)箱中，37℃，5%CO2，培養(yǎng)3h。翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，次日觀察無(wú)污染，繼續(xù)培養(yǎng)5～7天，見(jiàn)原代血管平滑肌細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%～90%，細(xì)胞單層融合，進(jìn)行消化傳代。每2天換1次液。傳至2～3代凍存。

1.2.2 姜黃素對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）MCP-1分泌的影響研究方法 取出平滑肌細(xì)胞進(jìn)行解凍、培養(yǎng)并傳代，取傳3～8代細(xì)胞，通過(guò)免疫組化法鑒定為血管平滑肌細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。根據(jù)作用藥物及濃度不同進(jìn)行分組。對(duì)照組（不加任何藥物），Ox-LDL 100 μg/mL組，Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素5 μmol/L組，Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素10 μmol/L組，Ox-LDL 100μg/mL+姜黃素30 μmol/L組。采用ELISA和RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞上清中MCP-1的濃度以及細(xì)胞MCP-1 mRNA的表達(dá)情況。

1.2.3 姜黃素對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)大鼠VSMCs增殖的影響研究方法 凍存細(xì)胞解凍，培養(yǎng)，傳代，鑒定為平滑肌細(xì)胞。根據(jù)作用藥物濃度進(jìn)行分組，對(duì)照組（不加任何藥物），Ox-LDL 100 μg/mL組，Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素20 μmol/L組，Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素40 μmol/L組，Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素80 μmol/L組。采用MTT法檢測(cè)OD值測(cè)定細(xì)胞增殖程度。

1.2.4 姜黃素對(duì)VSMCs誘導(dǎo)凋亡作用的研究方法 取凍存細(xì)胞解凍，培養(yǎng)傳代，鑒定為平滑肌細(xì)胞。按照加入藥物濃度進(jìn)行分組，對(duì)照組（不加任何藥物）姜黃素50 μmol/L組，姜黃素100 μmol/L組，姜黃素120 μmol/L組，檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，采用Western-blot方法檢測(cè)細(xì)胞caspase-8p10表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件數(shù)據(jù)處理，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)VSMCs MCP-1分泌及MCP-1 mRNA表達(dá)的影響

Ox-LDL 100 μg/mL組MCP-1分泌及MCP-1 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素10 μmol/L組和Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素30 μmol/L組MCP-1分泌及MCP-1 mRNA表達(dá)水平較Ox-LDL 100 μg/mL組顯著下降，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素 30 μmol/L組MCP-1分泌水平又顯著低于Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素5 μmol/L組和Ox-LDL 100μg/mL+姜黃素10 μmol/L組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 姜黃素對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)的VSMCs增殖影響

對(duì)照組OD值為（0.326±0.039），見(jiàn)圖1。Ox-LDL 100 μg/mL組OD值為（0.548±0.074），Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素20 μmol/L組OD值為（0.522±0.072），Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素40 μmol/L組OD值為（0.442±0.061），Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素80 μmol/L組OD值為（0.379±0.066）。各組之間比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 12.977，P < 0.01）。其中Ox-LDL 100 μg/mL組OD值顯著高于對(duì)照組，而Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素40 μmol/L組OD值和Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素80 μmol/L組OD值較Ox-LDL 100 μg/mL組OD值顯著下降，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。

A組：Ox-LDL 100 μg/mL組；B組：Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素20 μmol/L 組；C組為Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素 40 μmol/ L 組；D組：Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素 80 μmol/ L 組；與對(duì)照組比較，*P < 0.01；與A組比較，△P < 0.01；Ox-LDL：氧化型低密度脂蛋白

2.3 姜黃素對(duì)大鼠平滑肌細(xì)胞凋亡及caspase-8p10表達(dá)的影響

姜黃素50 μmol/L組、姜黃素100 μmol/L組、姜黃素120 μmol/L組大鼠平滑肌細(xì)胞凋亡率、caspase-8 p10表達(dá)較對(duì)照組顯著升高，姜黃素100 μmol/L組和姜黃素120 μmol/L組顯著高于姜黃素50 μmol/L組，而姜黃素120 μmol/L組又顯著高于姜黃素100 μmol/L組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見(jiàn)表2。提示隨著姜黃素濃度的升高，凋亡率及caspase-8p10表達(dá)升高越明顯。

3 討論

冠心病是中國(guó)首要的致死原因，由冠狀動(dòng)脈血管發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導(dǎo)致。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化，導(dǎo)致管腔狹窄、板塊破裂是導(dǎo)致冠心病的病理基礎(chǔ)。大量研究顯示血管平滑肌在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。動(dòng)脈粥樣硬化的板塊中存在來(lái)自血液的炎性細(xì)胞、免疫細(xì)胞、中性粒細(xì)胞，還包括來(lái)自血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞以及血管平滑肌細(xì)胞等[6]。血管內(nèi)皮功能障礙，促進(jìn)細(xì)胞和脂質(zhì)的滲透，脂質(zhì)蛋白氧化，血管平滑肌細(xì)胞增殖，血小板活化，血栓形成，導(dǎo)致粥樣硬化的啟動(dòng)。細(xì)胞因子在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中也發(fā)揮重要的作用，TF是凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)中重要的啟動(dòng)子，TF抗原、TFmRNA存在于多種細(xì)胞中，包括血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等[7]。環(huán)氧化酶-2在動(dòng)脈粥樣硬化組織中的表達(dá)顯著升高，特別表達(dá)于炎性巨細(xì)胞以及中層VSMCs中[8]。

低密度脂蛋白膽固醇（LDL）是血漿膽固醇主要的轉(zhuǎn)運(yùn)體。Ox-LDL是氧化修飾的低密度脂蛋白，被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)鍵的啟動(dòng)因素[9]。LDL中不飽和脂肪酸中的脂質(zhì)分子被氧化，產(chǎn)生大量的脂質(zhì)氧化物，脂質(zhì)氧化產(chǎn)物共價(jià)修飾apoB蛋白，產(chǎn)生乙醛類復(fù)合物，這些乙醛類的復(fù)合物進(jìn)一步氧化修飾脂蛋白氨基酸殘基，生成各種加合物，最終形成Ox-LDL[10-11]。Ox-LDL是一類經(jīng)化學(xué)修飾的脂蛋白顆粒的混合物，而不是單一成分。LDL氧化修飾機(jī)制包括金屬離子氧化法，髓過(guò)氧化物酶氧化作用，糖化LDL，一氧化氮及其氧化機(jī)制。在動(dòng)脈粥樣硬化劑血管性疾病的發(fā)病機(jī)制中，Ox-LDL必不可少。Ox-LDL可引起細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的變化，從而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞變性、壞死、脫落，導(dǎo)致血管內(nèi)皮完整性遭到破壞[12]。單核細(xì)胞以及LDL通過(guò)血管內(nèi)皮進(jìn)入內(nèi)膜下，形成脂質(zhì)條紋。Ox-LDL還能刺激單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌大量的言行因子、黏附因子、趨化因子，促使單核細(xì)胞核內(nèi)皮細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。遺傳性高脂血癥兔模型血漿Ox-LDL水平顯著升高，抗氧化劑能夠降低Ox-LDL水平，減輕動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。心絞痛患者血液中Ox-LDL水平顯著升高，外周血NF-κB活性升高，而在體外培養(yǎng)的單核細(xì)胞中加入Ox-LDL，能夠顯著增加NF-κB活性，這提示Ox-LDL能增加NF-κB活性，從而增加患者的氧化應(yīng)激反應(yīng)[13-14]。重組人IgG1抗體是針對(duì)Ox-LDL表位DNA修飾的apoB-100表位的抗體，研究證明其能顯著降低小鼠血液中Ox-LDL水平，說(shuō)明Ox-LDL抗體在降低血液中Ox-LDL水平，從而阻止動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程而發(fā)揮作用。

細(xì)胞趨化蛋白是一個(gè)蛋白質(zhì)家族，由十余種結(jié)構(gòu)有較大同源性、分子量多為8～10 kD的蛋白組成。單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）是β亞家族的代表，可趨化單核細(xì)胞。由內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等產(chǎn)生。MCP-1提高VSMC中MCPIP1 mRNA水平，并呈劑量和時(shí)間依賴性地上調(diào)MCPIP1蛋白表達(dá)[15]。和MCP-1處理的VSMC相比，MCPIP1基因沉默后VSMC的細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞活力及細(xì)胞DNA合成率均明顯降低，S期細(xì)胞數(shù)量下降；MCPIP1基因沉默可抑制MCP-1或PDGF對(duì)c-fos mRNA的上調(diào)作用。單核細(xì)胞趨化蛋白-1誘導(dǎo)蛋白通過(guò)介導(dǎo)單核細(xì)胞趨化蛋白-1誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的增殖[16]。MCP-1基因-2518A/G多態(tài)性與心肌梗死易感性具有密切的相關(guān)性[17]。

姜黃素是從姜科、天南星科中的一些植物的根莖中提取的一種化學(xué)成分，具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、利膽、抗氧化等作用。姜黃為常用中藥，其主要生物活性成分為姜黃素類和揮發(fā)油。前者具有降血脂、抗凝、抗氧化、利膽、抗癌等作用；而后者主要起抗炎、抗菌以及止咳作用[18-20]。姜黃素具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等作用，從而發(fā)揮抗癌作用。姜黃素對(duì)心血管疾病、關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)腫大等也具有臨床療效[18-22]。姜黃素能夠調(diào)節(jié)血脂水平，抑制細(xì)胞增殖，抗脂質(zhì)過(guò)氧化，抑制脂質(zhì)斑塊的形成，抗炎、抗凝血，抑制心肌重構(gòu)等。姜黃素能夠抑制人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞膜表面血栓調(diào)節(jié)蛋白和內(nèi)皮細(xì)胞活化蛋白的表達(dá)，還能夠抑制TNF-α介導(dǎo)的人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞膜表面TM、EPCR mRNA的表達(dá)，從而達(dá)到抑制和減少血栓形成的作用。

既往研究顯示Ox-LDL能夠促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞MCP-1的分泌而參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。在本研究中，Ox-LDL作用的大鼠血管平滑肌細(xì)胞MCP-1的分泌顯著增加，并且MCP mRNA的表達(dá)也顯著增加，這與既往的研究結(jié)果一致。而姜黃素具有抑制Ox-LDL誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞MCP-1的分泌以及MCP mRNA的表達(dá)，并且這種抑制作用隨著姜黃素弄高度的升高，作用越強(qiáng)。Ox-LDL能夠顯著誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞的增殖，而血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷徙與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生關(guān)系密切。在本次研究中，姜黃素對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，并且隨著姜黃素弄得的升高，抑制作用越明顯，說(shuō)明這樣的抑制作用具有濃度依賴性。平滑肌細(xì)胞凋亡不足時(shí)動(dòng)脈粥樣硬化早期進(jìn)展的主要因素，因此誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞凋亡可能會(huì)成為防治動(dòng)脈粥樣硬化的方法之一。在本研究中，姜黃素對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞具有顯著的誘導(dǎo)凋亡作用，并且隨著濃度的升高，這樣的誘導(dǎo)作用也逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明姜黃素誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞凋亡具有濃度依賴性。Caspase-8是凋亡的啟示因子，能夠啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的細(xì)胞外途徑和細(xì)胞內(nèi)途徑。在本研究中，姜黃素能夠顯著上調(diào)Caspase-8的表達(dá)，這可能是其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制。

綜上所述，Ox-LDL能夠上調(diào)大鼠血管平滑肌細(xì)胞MCP-1的表達(dá)以及MCP mRNA的表達(dá)，誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖，姜黃素對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞MCP-1、MCP mRNA的表達(dá)，以及細(xì)胞增殖具有抑制作用，且能誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞凋亡。

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（收稿日期：2014-03-31 本文編輯：蘇 暢）