巴西橡膠樹β—木糖苷酶基因的克隆與生物信息學分析

古小玲++涂敏

摘 要 以巴西橡膠樹根為材料，利用RT-PCR技術從總RNA中捕獲到一個β-木糖苷酶家族基因（β-xylosidase 或β-D-xyloside xylohydrolase，EC 3.2.1.37），cDNA長度2 880 bp，開放閱讀框2 319 bp，編碼773個氨基酸，命名為HbEC32。在HbEC32氨基酸序列中具有一個較強的跨膜區(qū)，二級結(jié)構分析表明其屬于混合型蛋白。HbEC32在N端前8～20氨基酸區(qū)域內(nèi)為較強的疏水區(qū)，但整條多肽鏈表現(xiàn)為親水性。對15個β-木糖苷酶蛋白進行系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，巴西橡膠樹的HbEC32基因與蓖麻親緣關系最近。

關鍵詞 巴西橡膠樹 ；HbEC32 ；基因克隆 ；序列分析

分類號 S794.1

橡膠產(chǎn)業(yè)面臨著多種病蟲害的危害，橡膠樹根病是其中的一類重要土傳性病害[1]。此類病害主要是由擔子菌和子囊菌中不同種的真菌危害巴西根系而造成，首先影響橡膠樹的生長，引起葉片發(fā)黃、樹枝缺水干枯，降低膠乳產(chǎn)量，最后直接導致整株樹死亡，造成巨大的經(jīng)濟損失[2-3]。目前研究表明，在植物與病原菌互作中，病原菌形成一系列入侵、快速生長、迅速擴散的機制；而植物細胞形成了含有大量的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的細胞壁，形成了堅固的壁壘[4]。其中，木聚糖酶是其入侵寄主植物的物質(zhì)基礎之一，植物木聚糖酶主要包括外切β-1，4-木聚糖酶、內(nèi)切β-1，4-木聚糖酶和β-木糖苷酶[5]。筆者在橡膠樹根中克隆到橡膠樹β-木糖苷酶相關基因，為橡膠樹木聚糖酶。深入對橡膠樹β-木糖苷酶基因進行研究，了解橡膠樹β-木糖苷酶在受根病病原菌侵染時的表達水平，是否存在表達相關的抑制性蛋白，對研究橡膠樹根病防治和抗根病具有重要意義。本研究以巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）嫩根為材料，通過比較分析多種植物的β-木糖苷酶基因的保守序列，設計特異引物，采用RT-PCR的方法獲得了HbEC32完整開放閱讀框序列，從而為橡膠樹根病致病機理研究和橡膠樹抗根病分子育種奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

樹根：巴西橡膠樹熱研7-33-97品系的組培苗的幼嫩根，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所國家種質(zhì)資源圃提供。

試劑：高保真Taq酶、T4 DNA連接酶、RNA酶抑制劑、pMD19-T載體（大連寶生物公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司），感受態(tài)細胞菌種為Escherichia coli JM109（北京全式金生物技術有限公司），DNA凝膠和PCR產(chǎn)物回收試劑盒（Axygen公司）。

引物合成與測序送深圳華大完成。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和cDNA第一鏈的合成

采用改良的CTAB法[3]提取巴西橡膠樹熱研7-33-97品系組培苗嫩根的總RNA。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，取1 μg總RNA進行cDNA第一鏈的合成，具體操作按產(chǎn)品說明書進行。

1.2.2 HbEC32的克隆與序列測定

從NCBI網(wǎng)站獲取已發(fā)表的人參、番茄、蓖麻、葡萄等作物[6-9]的β-木糖苷酶基因序列，通過生物信息學分析軟件，進行同源性比對，利用保守區(qū)域的序列設計引物，正向引物5′-GTTTGTTAGCTCTTTACTCTCTATCAAC-3′反向引物5′-TGGGAGTATGAAAAAAA TAATAATAAT-3′，采用RT-PCR技術進行基因克隆，獲取基因開放閱讀框完整序列。以1.2.1獲得的cDNA第一鏈為模板50 ng，進行PCR擴增，擴增體系為20 μL。擴增程序為：95℃變性5 min，94℃變性30 S，58℃退火30 S，72℃延伸2.5 min，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸15 min。利用1.0%瓊脂糖凝膠，電泳分離PCR擴增產(chǎn)物，在紫外燈下回收目的條帶；利用DNA凝膠和PCR產(chǎn)物回收試劑盒進行純化回收，回收的目的片段克隆到載體pMD19-T，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中，篩選陽性菌株送測序。

1.2.3 HbEC32基因生物信息學分析

對以獲得的基因序列進行相關的生物信息學分析。通過DNAMAN軟件對目的基因開放閱讀框的預測、以及蛋白的基本性質(zhì)進行分析；利用NCBI序列比對分析目的基因的氨基酸保守結(jié)構域；利用Predict Protein、TMpred和ServerProtScale在線蛋白質(zhì)分析軟件分析HbEC32蛋白的二級結(jié)構、跨膜方向、蛋白質(zhì)跨膜區(qū)、疏水性和親水性；利用Clustal X 1.83軟件對15個不同來源的β-木糖苷酶相關基因進行系統(tǒng)進化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA與反轉(zhuǎn)錄cDNA的檢測

電泳結(jié)果表明，通過改良的CTAB法提取的橡膠樹幼嫩根RNA完整性很好（圖1）。由圖1可以看出，28 S條帶比18 S條帶亮2倍，無拖尾；A260/A280比值在1.80～2.0，提取的RNA純度達到反轉(zhuǎn)錄cDNA要求；反轉(zhuǎn)錄cDNA的擴增產(chǎn)物在1 100 bp左右，條帶清晰、亮度適中（圖2），提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA質(zhì)量較好，可用于后續(xù)的基因擴增。

2.2 HbEC32的RT-PCR擴增

1.0%瓊脂糖凝膠上電泳結(jié)果顯示，4個重復泳道，都出現(xiàn)清晰的唯一條帶，對比Marker，大小在3 000 bp左右的地方（圖3），PCR擴增產(chǎn)物與引物設計的目的片段的分子量大小相一致，可以用于下一步回收、連接、轉(zhuǎn)化送測序。

2.3 HbEC32的序列分析

DNAMAN軟件對目的基因測序分析表明，獲得的HbEC32基因長度2 880 bp，開放閱讀框2 319 bp，編碼氨基酸773個（圖4），分子量約為85.15 ku，理論等電點為7.90。通過NCBI比對結(jié)果來知，目標蛋白與糖基水解酶家族和木糖糖苷酶有很高的同源性（圖5）。HbEC32蛋白的二級結(jié)構預測結(jié)果中，α螺旋（H）占25.90%，β折疊（E）占15.80%，無規(guī)則卷曲（L）占58.30%，預測HbEC32蛋白屬于混合型蛋白（圖6）。endprint

2.4 HbEC32蛋白的親水性/疏水性分析

巴西橡膠樹HbEC32蛋白的疏水性/親水性在線預測結(jié)果表明：HbEC32蛋白多肽鏈在第15位表現(xiàn)出最強的疏水性，分值為2.78；在第710位表現(xiàn)出最強的親水性，分值為-2.94；N端前8～20氨基酸范圍內(nèi)有一較強的疏水區(qū)；總體來說，此多肽鏈表現(xiàn)出較強的親水性（圖7）。

2.5 HbEC32蛋白跨膜區(qū)分析

TMpred進行蛋白質(zhì)跨膜區(qū)和跨膜方向的預測結(jié)果表明，HbEC32蛋白氨基酸序列中3～24和524～544處出現(xiàn)分值1367和561的跨膜結(jié)構域，屬可溶性型、可跨膜蛋白類（圖8），這一結(jié)果與ProtScale預測的HbEC32蛋白多肽鏈表現(xiàn)為親水性一致。

2.6 HbEC32基因的進化分析

利用Clustal X 1.83軟件對HbEC32基因進行系統(tǒng)進化分析，結(jié)果顯示：15個β-木糖苷酶基因可分為2大類，可可的β-木糖苷酶基因家族4號基因與其它的進化距離較大，其他物種和橡膠樹HbEC32歸為一類，其中蓖麻和橡膠樹進化距離最近（圖9）。

說明：15個β-木糖苷酶基因：橡膠樹（Hb）、蓖麻（Rc）、毛楊（Pt）、可可（Tc1、Tc2、Tc3、Tc4）、甜橙（Cs）、野草莓（Fv）、葡萄（Vv）、擬南芥（At3、At7）、馬鈴薯（St）、碧桃（Pp）、鷹嘴豆（Ca）。

3 討論與結(jié)論

在植物與病原菌互作中，分泌細胞壁降解酶是病原菌的一種入侵機制[10]。而寄主植物為防御病原菌的侵入，一方面主動識別病原菌木聚糖酶，使木聚糖酶作為激發(fā)子引發(fā)宿主的一系列防衛(wèi)反應[11]，另一方面，寄主植物通過合成木聚糖酶抑制蛋白來抑制病原菌木聚糖酶的活性，產(chǎn)生防御效果[12]。寄主植物的抑制蛋白會根據(jù)病原菌的木聚糖酶的不同而形成一系列結(jié)構、表達模式、作用特異性等特征各異的家族成員，而且這種變化常常是由很少數(shù)的幾個氨基酸殘基的結(jié)構決定的[13]。

目前，橡膠樹的木聚糖酶家族基因的研究還比較少，而橡膠樹中真菌病害卻比較多。本研究從橡膠樹根中分離得到的β-木糖苷酶基因是木聚糖酶龐大家族的一員，推測對于橡膠樹根病病原菌來說，木聚糖酶可能是其入侵寄主植物的物質(zhì)基礎，與橡膠樹的細胞壁合成和病原菌防御有著密切的關系。但確定其是否能夠影響橡膠樹的抗病性，還需后續(xù)進一步進行功能和表達分析的研究。本研究獲得的橡膠樹β-木糖苷酶基因?qū)橄鹉z樹根病防治和抗根病研究奠定一定的分子理論基礎。

致 謝 感謝中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所國家天然橡膠種質(zhì)資源圃提供巴西橡膠樹品系熱研7-33-97的樹根材料。

參考文獻

[1] 黃宗道. 熱帶北緣橡膠樹栽培[M]. 廣州：廣東科技出版社，1987.

[2] 黃貴修，許燦光. 中國天然橡膠病蟲草害識別與防治[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2012.

[3] 安澤偉，黃 華. 一種提取橡膠樹葉中總DNA的方法[J]. 植物生理學通訊，2005（4）：513-515.

[4] 黃宗慶. 木糖苷酶的酶學性質(zhì)分析及定向進化[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2013.

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[7] Itai A， Ishihara K， Bewley D. Characterization of expression， and cloning， of β-d-xylosidase and α-L-arabinofuranosidase in developing and ripening tomato （Lycopersicon esculentum Mill.） fruit[J]. Exp Bot， 2003， 54： 2 615-2 622.

[8] Ronen R， Zauberman G， Akerman M， et al. Xylanase and xylosidase activities in avocado fruit[J]. Plant Physiol，1991，95（3）：961-964.

[9] Minic Z， Rihouey C， Cao T Do， et al. Purification and characterization of enzymes exhibiting β-d-xylosidase activities in stem tissues of Arabidopsis[J]. Plant Physiol， 2004， 135（2）：867-878.

[10] Yejun Han，Hongzhang Chen. A β-xylosidase from cell wall of maize： Purification， properties and its use in hydrolysis of plant cell wall[J]. Journal of Molecular Catalysis B： Enzymatic， 2010， 63（3-4）： 135-140.

[11] 王 瑾. 茶樹葉部由病原真菌侵染引發(fā)的內(nèi)源糖苷酶及咖啡堿合成相關酶基因差異表達[D]. 合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學，2011.

[12] 周 潔，鄭祥梓，蘭 斕，等. 稻瘟病菌假定的糖基水解酶62家族初步研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，2009（8）：2 754-2 762.

[13] Claudia A，Bustamante，Pedro M Civello，et al. Cloning of the promoter region of β-xylosidase （FaXyl1） gene and effect of plant growth regulators on the expression of FaXyl1in strawberry fruit[J]. Plant Science， 2009， 177： 49-56.endprint

2.4 HbEC32蛋白的親水性/疏水性分析

巴西橡膠樹HbEC32蛋白的疏水性/親水性在線預測結(jié)果表明：HbEC32蛋白多肽鏈在第15位表現(xiàn)出最強的疏水性，分值為2.78；在第710位表現(xiàn)出最強的親水性，分值為-2.94；N端前8～20氨基酸范圍內(nèi)有一較強的疏水區(qū)；總體來說，此多肽鏈表現(xiàn)出較強的親水性（圖7）。

2.5 HbEC32蛋白跨膜區(qū)分析

TMpred進行蛋白質(zhì)跨膜區(qū)和跨膜方向的預測結(jié)果表明，HbEC32蛋白氨基酸序列中3～24和524～544處出現(xiàn)分值1367和561的跨膜結(jié)構域，屬可溶性型、可跨膜蛋白類（圖8），這一結(jié)果與ProtScale預測的HbEC32蛋白多肽鏈表現(xiàn)為親水性一致。

2.6 HbEC32基因的進化分析

利用Clustal X 1.83軟件對HbEC32基因進行系統(tǒng)進化分析，結(jié)果顯示：15個β-木糖苷酶基因可分為2大類，可可的β-木糖苷酶基因家族4號基因與其它的進化距離較大，其他物種和橡膠樹HbEC32歸為一類，其中蓖麻和橡膠樹進化距離最近（圖9）。

說明：15個β-木糖苷酶基因：橡膠樹（Hb）、蓖麻（Rc）、毛楊（Pt）、可可（Tc1、Tc2、Tc3、Tc4）、甜橙（Cs）、野草莓（Fv）、葡萄（Vv）、擬南芥（At3、At7）、馬鈴薯（St）、碧桃（Pp）、鷹嘴豆（Ca）。

3 討論與結(jié)論

在植物與病原菌互作中，分泌細胞壁降解酶是病原菌的一種入侵機制[10]。而寄主植物為防御病原菌的侵入，一方面主動識別病原菌木聚糖酶，使木聚糖酶作為激發(fā)子引發(fā)宿主的一系列防衛(wèi)反應[11]，另一方面，寄主植物通過合成木聚糖酶抑制蛋白來抑制病原菌木聚糖酶的活性，產(chǎn)生防御效果[12]。寄主植物的抑制蛋白會根據(jù)病原菌的木聚糖酶的不同而形成一系列結(jié)構、表達模式、作用特異性等特征各異的家族成員，而且這種變化常常是由很少數(shù)的幾個氨基酸殘基的結(jié)構決定的[13]。

目前，橡膠樹的木聚糖酶家族基因的研究還比較少，而橡膠樹中真菌病害卻比較多。本研究從橡膠樹根中分離得到的β-木糖苷酶基因是木聚糖酶龐大家族的一員，推測對于橡膠樹根病病原菌來說，木聚糖酶可能是其入侵寄主植物的物質(zhì)基礎，與橡膠樹的細胞壁合成和病原菌防御有著密切的關系。但確定其是否能夠影響橡膠樹的抗病性，還需后續(xù)進一步進行功能和表達分析的研究。本研究獲得的橡膠樹β-木糖苷酶基因?qū)橄鹉z樹根病防治和抗根病研究奠定一定的分子理論基礎。

致 謝 感謝中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所國家天然橡膠種質(zhì)資源圃提供巴西橡膠樹品系熱研7-33-97的樹根材料。

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[13] Claudia A，Bustamante，Pedro M Civello，et al. Cloning of the promoter region of β-xylosidase （FaXyl1） gene and effect of plant growth regulators on the expression of FaXyl1in strawberry fruit[J]. Plant Science， 2009， 177： 49-56.endprint

2.4 HbEC32蛋白的親水性/疏水性分析

巴西橡膠樹HbEC32蛋白的疏水性/親水性在線預測結(jié)果表明：HbEC32蛋白多肽鏈在第15位表現(xiàn)出最強的疏水性，分值為2.78；在第710位表現(xiàn)出最強的親水性，分值為-2.94；N端前8～20氨基酸范圍內(nèi)有一較強的疏水區(qū)；總體來說，此多肽鏈表現(xiàn)出較強的親水性（圖7）。

2.5 HbEC32蛋白跨膜區(qū)分析

TMpred進行蛋白質(zhì)跨膜區(qū)和跨膜方向的預測結(jié)果表明，HbEC32蛋白氨基酸序列中3～24和524～544處出現(xiàn)分值1367和561的跨膜結(jié)構域，屬可溶性型、可跨膜蛋白類（圖8），這一結(jié)果與ProtScale預測的HbEC32蛋白多肽鏈表現(xiàn)為親水性一致。

2.6 HbEC32基因的進化分析

利用Clustal X 1.83軟件對HbEC32基因進行系統(tǒng)進化分析，結(jié)果顯示：15個β-木糖苷酶基因可分為2大類，可可的β-木糖苷酶基因家族4號基因與其它的進化距離較大，其他物種和橡膠樹HbEC32歸為一類，其中蓖麻和橡膠樹進化距離最近（圖9）。

說明：15個β-木糖苷酶基因：橡膠樹（Hb）、蓖麻（Rc）、毛楊（Pt）、可可（Tc1、Tc2、Tc3、Tc4）、甜橙（Cs）、野草莓（Fv）、葡萄（Vv）、擬南芥（At3、At7）、馬鈴薯（St）、碧桃（Pp）、鷹嘴豆（Ca）。

3 討論與結(jié)論

在植物與病原菌互作中，分泌細胞壁降解酶是病原菌的一種入侵機制[10]。而寄主植物為防御病原菌的侵入，一方面主動識別病原菌木聚糖酶，使木聚糖酶作為激發(fā)子引發(fā)宿主的一系列防衛(wèi)反應[11]，另一方面，寄主植物通過合成木聚糖酶抑制蛋白來抑制病原菌木聚糖酶的活性，產(chǎn)生防御效果[12]。寄主植物的抑制蛋白會根據(jù)病原菌的木聚糖酶的不同而形成一系列結(jié)構、表達模式、作用特異性等特征各異的家族成員，而且這種變化常常是由很少數(shù)的幾個氨基酸殘基的結(jié)構決定的[13]。

目前，橡膠樹的木聚糖酶家族基因的研究還比較少，而橡膠樹中真菌病害卻比較多。本研究從橡膠樹根中分離得到的β-木糖苷酶基因是木聚糖酶龐大家族的一員，推測對于橡膠樹根病病原菌來說，木聚糖酶可能是其入侵寄主植物的物質(zhì)基礎，與橡膠樹的細胞壁合成和病原菌防御有著密切的關系。但確定其是否能夠影響橡膠樹的抗病性，還需后續(xù)進一步進行功能和表達分析的研究。本研究獲得的橡膠樹β-木糖苷酶基因?qū)橄鹉z樹根病防治和抗根病研究奠定一定的分子理論基礎。

致 謝 感謝中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所國家天然橡膠種質(zhì)資源圃提供巴西橡膠樹品系熱研7-33-97的樹根材料。

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[8] Ronen R， Zauberman G， Akerman M， et al. Xylanase and xylosidase activities in avocado fruit[J]. Plant Physiol，1991，95（3）：961-964.

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[11] 王 瑾. 茶樹葉部由病原真菌侵染引發(fā)的內(nèi)源糖苷酶及咖啡堿合成相關酶基因差異表達[D]. 合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學，2011.

[12] 周 潔，鄭祥梓，蘭 斕，等. 稻瘟病菌假定的糖基水解酶62家族初步研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，2009（8）：2 754-2 762.

[13] Claudia A，Bustamante，Pedro M Civello，et al. Cloning of the promoter region of β-xylosidase （FaXyl1） gene and effect of plant growth regulators on the expression of FaXyl1in strawberry fruit[J]. Plant Science， 2009， 177： 49-56.endprint