蛹蟲草子實體蟲草多糖提取工藝的優(yōu)化

殷東林　王銳麗　段鴻斌

摘要：以蛹蟲草子實體為材料，研究蟲草多糖的提取工藝，探討熱水浸提法、超聲波助提法、微波助提法和索氏提取法4種提取方法的效果。結果發(fā)現(xiàn)，微波助提法是蟲草多糖的最佳提取方法。通過正交試驗考察了微波助提法中微波功率、微波時間、提取次數(shù)、料液比4個因素對蟲草多糖提取效率的影響，建立了提取蟲草多糖的最佳工藝，即微波功率420 W、微波處理時間4 min、提取次數(shù)3次、料液比1 g ∶40 mL，此時提取率可達9.34%以上。

關鍵詞：蛹蟲草；蟲草多糖；提取工藝；正交試驗；優(yōu)化

中圖分類號： R284.2 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0277-02

收稿日期：2013-10-24

基金項目：河南省科技攻關（編號：132102110047）。

作者簡介：殷東林（1983—），男，河南潢川人，碩士，講師，主要從事生物技術的研究。E-mail：ydl669@126.com。蛹蟲草[Cordyceps militaris （Linn.）Link]為子囊菌亞門麥角菌目麥角菌科蟲草屬的模式種[1]，是一種藥食兩用的名貴食用菌。蛹蟲草所含的蟲草多糖、蟲草酸和蟲草菌素均高于冬蟲夏草，其獨特藥理作用已日益引起藥學界的高度重視。研究表明，蟲草多糖是一種半乳甘露聚糖，它能促進淋巴細胞轉(zhuǎn)化，提高血清IgG的抗體含量和機體的免疫功能，增強機體自身抗癌、抑癌的能力。它不僅能激活T、B淋巴細胞、巨噬細胞和自然殺傷細胞，還能活化補體、促進細胞因子包括腫瘤壞死因子和白細胞介素生成，從而對免疫系統(tǒng)發(fā)揮多方面的調(diào)節(jié)作用[2-3]。此外，多糖還具有抗炎作用，且效果明顯，其發(fā)酵液中有抗菌活性物質(zhì)，對金黃色葡萄球菌、馬鈴薯芽孢桿菌等均有明顯的抑制作用，在研制新型殺菌劑和保鮮劑方面有良好的應用前景[4]。

目前，蟲草多糖的提取方法有熱水浸提法、堿提取法、稀酸浸提法和酶提取法等。其中，最常用、最簡單有效的方法是熱水浸提法，首先用蒸餾水浸潤物料，再用熱水浴浸提，然后利用多糖易溶于水而不溶于高濃度乙醇的性質(zhì)，用無水乙醇沉淀得到多糖，即采用水提醇沉的辦法。

為了進一步提高提取率、縮短提取時間，可用超聲波輔助浸提和微波輔助浸提，這2種方法操作簡單且不會引入雜質(zhì)。超聲波能破壞細胞和細胞膜結構，增加細胞內(nèi)容物通過細胞膜的穿透能力，有助于多糖的釋放與溶出，超聲波使提取液不斷振蕩，有助于溶質(zhì)擴散，縮短提取時間，提高有效成分的提取率和原料的利用率[5]；微波透過提取溶劑到達物料內(nèi)部，使之快速升溫，進而使其細胞內(nèi)部壓力增大。當壓力超過細胞壁所能承受的能力時，細胞壁破裂，胞內(nèi)有效成分易流出，從而易進入提取溶劑[6]。本研究采取單因素分析法和多因素正交分析法，對蟲草多糖提取工藝進行優(yōu)化，旨在為蟲草多糖的提取提供一套快速、高效的方法。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑無水乙醇、濃硫酸、蒽酮，均為市售分析純；蒸餾水。

1.1.2器材用具高速粉碎機，80目篩，電子天平（上海越平科學儀器有限公司），微量移液器（上海求精生化試劑儀器有限公司），數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海梅香儀器有限公司），JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機（浙江寧波新芝生物科技股份有限公司），微波爐（廣東省佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE52-86A（上海亞榮生化儀器廠），DHG-9023AS型電熱恒溫鼓風干燥箱（浙江寧波東南儀器有限公司），TU-1810紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）。

1.1.3材料蛹蟲草由信陽農(nóng)林學院生物技術系實驗室培養(yǎng)。蛹蟲草子實體干燥后粉碎，過 80目篩。

1.2方法

1.2.1蟲草多糖的提取用單因素分析法確定蟲草多糖最佳提取方法：（1）熱水浸提法。取干質(zhì)量 1 g蛹蟲草粉，加入30 mL蒸餾水，80 ℃水浴提取 2 h，提取結束后抽濾提取液，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液濃縮到適當體積。（2）超聲波助提法。取干質(zhì)量1 g蛹蟲草粉，加入55 mL蒸餾水，用超聲波細胞破碎儀400 W處理90次，每次5 s，然后轉(zhuǎn)入水浴80 ℃提取2 h，提取結束后抽濾提取液，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液濃縮到適當體積。（3）微波助提法。取干質(zhì)量1 g蛹蟲草粉，加入80 ℃蒸餾水40 mL，靜置 20 min濕潤物料，微波功率為420 W 下輻射1 min，間隔 1 min后再輻射1 min，如此間隔輻射直至總輻射時間達到 4 min，然后轉(zhuǎn)入水浴溫度為80 ℃下提取1 h，提取結束后抽濾提取液，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮到適當體積。（4）索氏提取法。取干質(zhì)量1 g蛹蟲草粉，用 120 mL 蒸餾水于 80～100 ℃下熱回流3次，收集提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至適當體積。以上4種方法均做3個重復，結果取平均值。得到的提取液濃縮到適當體積后，加入3倍體積的無水乙醇，靜置過夜，進行醇析，所得沉淀在45 ℃條件下烘干；再用60 ℃蒸餾水將沉淀溶解，并定容到100 mL，即得粗多糖原始樣品溶液。從每組樣品溶液中準確吸取 2.5 mL 至100 mL容量瓶中并定容（即將樣品提取液稀釋40倍），用蒽酮-硫酸法測定樣品的吸光度。

1.2.2蒽酮-硫酸法檢測多糖含量

1.2.2.1對照品溶液的配制精確稱取在105 ℃下干燥至恒重的葡萄糖 0.05 g，加蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，搖勻，即得0.5 mg/mL葡萄糖標準溶液。

1.2.2.22 g/L硫酸蒽酮試液的配制量取濃硫酸 100 mL于燒杯中，精確稱取蒽酮 0.2 g加入濃硫酸中，攪拌溶解即得，然后轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2.3供試品溶液的制備取最后稀釋到適當體積的樣品提取液，測定樣品的吸光度。

1.2.3葡萄糖標準曲線的繪制精確量取葡萄糖對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，分別精確量取上述溶液 1 mL 于具塞試管中，另取蒸餾水1 mL置于25 mL比色管中作空白對照，置冰水浴中，再精確加入蒽酮-硫酸試劑4 mL，然后在沸水浴中加熱15 min（自加入沸水中即開始計時），之后用自來水冷卻。以空白為參比，在 625 nm波長處測定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標、吸光度（y）為縱坐標繪制標準曲線。endprint

1.2.4樣品含量測定精確量取樣品提取液1 mL，置冰水浴中，再精確加入蒽酮-硫酸試劑 4 mL，然后在沸水浴中加熱15 min（自加入沸水中即開始計時），之后用自來水冷卻。以蒸餾水為對照，在 625 nm波長處測定吸光度。測得吸光度代入標準曲線方程，計算樣品中多糖的含量。

1.2.5提取率計算多糖提取率=測得的多糖含量/蛹蟲草粉末質(zhì)量 ×100%。

1.2.6蟲草多糖提取工藝的優(yōu)化用L9（34）正交試驗法研究微波助提法中的4個因素（微波功率、微波時間、提取次數(shù)、料液比，分別取3個水平）對蟲草多糖提取的影響，以確定最佳提取條件。L9（34）正交試驗蟲草多糖提取的影響因素及水平見表1。

3結論與討論

本研究以蛹蟲草子實體為材料，研究蟲草多糖的提取工藝，探討熱水浸提法、超聲波助提法、微波助提法和索氏提取法4種提取方法對蟲草多糖提取效果的影響，通過單因素試驗確定最佳提取方法為微波助提法，其多糖提取率為6.92%。

通過正交試驗考察微波助提法中微波功率、微波時間、提取次數(shù)、料液比4個因素對蟲草多糖提取率的影響，建立提取蟲草多糖的最佳工藝條件，即微波功率420 W、微波處理時間4 min、提取次數(shù)3次、料液比1 g ∶40 mL，此時提取率可達934%以上。

由于蛹蟲草成分復雜，熱提取過程中單糖、水溶性蛋白以及鞣質(zhì)等一系列雜質(zhì)也會被一并提出，為多糖的純化帶來困難，所以，本試驗所得的多糖含有一定的蛋白質(zhì)。

熱水浸提法是最常用、最簡單有效的多糖提取方法，但該方法耗時較長，提取率也有待提高。為了進一步提高提取率、縮短提取時間，本研究確定用微波助提法加以優(yōu)化。微波能

透過提取溶劑到達物料內(nèi)部，使之快速升溫，進而使其細胞內(nèi)部壓力增大。當壓力超過細胞壁所能承受的能力時，細胞壁破裂，胞內(nèi)有效成分易于流出，從而易于進入提取溶劑。但所用微波功率過大或處理時間過長可能會使有效成分分解，造成損失，所以可通過正交試驗確定最佳提取條件。總之，微波輔助萃取技術具有快速、萃取率高、成本低、質(zhì)量好等優(yōu)點，是天然產(chǎn)物萃取中一種非常有發(fā)展?jié)摿Φ男滦图夹g。

參考文獻：

[1]梁宗琦. 中國真菌志：第三十二卷蟲草屬[M]. 北京：科學出版社，2007.

[2]吳鳳瑤. 蛹蟲草多糖的分子結構及生物學活性研究[D]. 鎮(zhèn)江：江蘇科技大學，2011.

[3]吳光昊，王旻. 蛹蟲草多糖的分離及免疫活性的研究[J]. 中國天然藥物，2007，5（1）：73-76.

[4]賓文，宋麗艷，于榮敏. 人工培養(yǎng)蛹蟲草多糖抗炎及免疫作用的研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2003，14（1）：1-2.

[5]秦秀麗，李鳳林. 超聲波法提取蛹蟲草多糖的工藝研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2011，39（5）：378-380.

[6]施英，吳娛明，廖森泰，等. 微波輔助提取蠶蛹蟲草多糖的研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學，2006（11）：41-42.endprint

1.2.4樣品含量測定精確量取樣品提取液1 mL，置冰水浴中，再精確加入蒽酮-硫酸試劑 4 mL，然后在沸水浴中加熱15 min（自加入沸水中即開始計時），之后用自來水冷卻。以蒸餾水為對照，在 625 nm波長處測定吸光度。測得吸光度代入標準曲線方程，計算樣品中多糖的含量。

1.2.5提取率計算多糖提取率=測得的多糖含量/蛹蟲草粉末質(zhì)量 ×100%。

1.2.6蟲草多糖提取工藝的優(yōu)化用L9（34）正交試驗法研究微波助提法中的4個因素（微波功率、微波時間、提取次數(shù)、料液比，分別取3個水平）對蟲草多糖提取的影響，以確定最佳提取條件。L9（34）正交試驗蟲草多糖提取的影響因素及水平見表1。

3結論與討論

本研究以蛹蟲草子實體為材料，研究蟲草多糖的提取工藝，探討熱水浸提法、超聲波助提法、微波助提法和索氏提取法4種提取方法對蟲草多糖提取效果的影響，通過單因素試驗確定最佳提取方法為微波助提法，其多糖提取率為6.92%。

通過正交試驗考察微波助提法中微波功率、微波時間、提取次數(shù)、料液比4個因素對蟲草多糖提取率的影響，建立提取蟲草多糖的最佳工藝條件，即微波功率420 W、微波處理時間4 min、提取次數(shù)3次、料液比1 g ∶40 mL，此時提取率可達934%以上。

由于蛹蟲草成分復雜，熱提取過程中單糖、水溶性蛋白以及鞣質(zhì)等一系列雜質(zhì)也會被一并提出，為多糖的純化帶來困難，所以，本試驗所得的多糖含有一定的蛋白質(zhì)。

熱水浸提法是最常用、最簡單有效的多糖提取方法，但該方法耗時較長，提取率也有待提高。為了進一步提高提取率、縮短提取時間，本研究確定用微波助提法加以優(yōu)化。微波能

透過提取溶劑到達物料內(nèi)部，使之快速升溫，進而使其細胞內(nèi)部壓力增大。當壓力超過細胞壁所能承受的能力時，細胞壁破裂，胞內(nèi)有效成分易于流出，從而易于進入提取溶劑。但所用微波功率過大或處理時間過長可能會使有效成分分解，造成損失，所以可通過正交試驗確定最佳提取條件?？傊?，微波輔助萃取技術具有快速、萃取率高、成本低、質(zhì)量好等優(yōu)點，是天然產(chǎn)物萃取中一種非常有發(fā)展?jié)摿Φ男滦图夹g。

參考文獻：

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[2]吳鳳瑤. 蛹蟲草多糖的分子結構及生物學活性研究[D]. 鎮(zhèn)江：江蘇科技大學，2011.

[3]吳光昊，王旻. 蛹蟲草多糖的分離及免疫活性的研究[J]. 中國天然藥物，2007，5（1）：73-76.

[4]賓文，宋麗艷，于榮敏. 人工培養(yǎng)蛹蟲草多糖抗炎及免疫作用的研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2003，14（1）：1-2.

[5]秦秀麗，李鳳林. 超聲波法提取蛹蟲草多糖的工藝研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2011，39（5）：378-380.

[6]施英，吳娛明，廖森泰，等. 微波輔助提取蠶蛹蟲草多糖的研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學，2006（11）：41-42.endprint

1.2.4樣品含量測定精確量取樣品提取液1 mL，置冰水浴中，再精確加入蒽酮-硫酸試劑 4 mL，然后在沸水浴中加熱15 min（自加入沸水中即開始計時），之后用自來水冷卻。以蒸餾水為對照，在 625 nm波長處測定吸光度。測得吸光度代入標準曲線方程，計算樣品中多糖的含量。

1.2.5提取率計算多糖提取率=測得的多糖含量/蛹蟲草粉末質(zhì)量 ×100%。

1.2.6蟲草多糖提取工藝的優(yōu)化用L9（34）正交試驗法研究微波助提法中的4個因素（微波功率、微波時間、提取次數(shù)、料液比，分別取3個水平）對蟲草多糖提取的影響，以確定最佳提取條件。L9（34）正交試驗蟲草多糖提取的影響因素及水平見表1。

3結論與討論

本研究以蛹蟲草子實體為材料，研究蟲草多糖的提取工藝，探討熱水浸提法、超聲波助提法、微波助提法和索氏提取法4種提取方法對蟲草多糖提取效果的影響，通過單因素試驗確定最佳提取方法為微波助提法，其多糖提取率為6.92%。

通過正交試驗考察微波助提法中微波功率、微波時間、提取次數(shù)、料液比4個因素對蟲草多糖提取率的影響，建立提取蟲草多糖的最佳工藝條件，即微波功率420 W、微波處理時間4 min、提取次數(shù)3次、料液比1 g ∶40 mL，此時提取率可達934%以上。

由于蛹蟲草成分復雜，熱提取過程中單糖、水溶性蛋白以及鞣質(zhì)等一系列雜質(zhì)也會被一并提出，為多糖的純化帶來困難，所以，本試驗所得的多糖含有一定的蛋白質(zhì)。

熱水浸提法是最常用、最簡單有效的多糖提取方法，但該方法耗時較長，提取率也有待提高。為了進一步提高提取率、縮短提取時間，本研究確定用微波助提法加以優(yōu)化。微波能

透過提取溶劑到達物料內(nèi)部，使之快速升溫，進而使其細胞內(nèi)部壓力增大。當壓力超過細胞壁所能承受的能力時，細胞壁破裂，胞內(nèi)有效成分易于流出，從而易于進入提取溶劑。但所用微波功率過大或處理時間過長可能會使有效成分分解，造成損失，所以可通過正交試驗確定最佳提取條件。總之，微波輔助萃取技術具有快速、萃取率高、成本低、質(zhì)量好等優(yōu)點，是天然產(chǎn)物萃取中一種非常有發(fā)展?jié)摿Φ男滦图夹g。

參考文獻：

[1]梁宗琦. 中國真菌志：第三十二卷蟲草屬[M]. 北京：科學出版社，2007.

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[3]吳光昊，王旻. 蛹蟲草多糖的分離及免疫活性的研究[J]. 中國天然藥物，2007，5（1）：73-76.

[4]賓文，宋麗艷，于榮敏. 人工培養(yǎng)蛹蟲草多糖抗炎及免疫作用的研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2003，14（1）：1-2.

[5]秦秀麗，李鳳林. 超聲波法提取蛹蟲草多糖的工藝研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2011，39（5）：378-380.

[6]施英，吳娛明，廖森泰，等. 微波輔助提取蠶蛹蟲草多糖的研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學，2006（11）：41-42.endprint