溫度、pH值和貯藏方式對(duì)大喇叭杜鵑花粉萌發(fā)的影響

陸琳　解瑋佳　李云生等

摘要：采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)法研究了培養(yǎng)溫度、pH值和貯藏方式對(duì)大喇叭杜鵑花粉萌發(fā)的影響，結(jié)果表明：培養(yǎng)溫度對(duì)大喇叭杜鵑花粉萌發(fā)的影響較大，25～30 ℃下培養(yǎng)，大喇叭杜鵑花粉的萌發(fā)生長(zhǎng)較好，且以25 ℃最佳；花粉在外源pH值為4～6的條件下能夠正常萌發(fā)，且最適合其萌發(fā)的pH值為4.5～5.0，萌發(fā)率達(dá)87%；室溫、4 ℃、-18 ℃等3種貯藏方式中以-18 ℃的貯藏效果最佳，貯藏4個(gè)月后的花粉萌發(fā)率仍有68.3%。

關(guān)鍵詞：大喇叭杜鵑；花粉萌發(fā)；溫度；pH值；貯藏

中圖分類號(hào)： S685.210.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）07-0186-02

收稿日期：2013-10-22

基金項(xiàng)目：云南省科技計(jì)劃（編號(hào)：2011EB110）。

作者簡(jiǎn)介：陸琳（1976—），女，云南昆明人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事云南特色園林花卉的種質(zhì)資源創(chuàng)新研究。Tel：（0871）65892602；E-mail：Lu_lin2005@sina.com。

通信作者：李樹(shù)發(fā)，男，碩士，研究員，主要從事云南特色花卉新品種選育及產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)應(yīng)用研究。Tel：（0871）65892602；E-mail：lsf206498@126.com。云南省是杜鵑花的世界分布中心之一，有著豐富的種質(zhì)資源[1-3]。大喇叭杜鵑（Rhododendron excellens Hemsl.et Wils.）為杜鵑花科杜鵑花屬常綠灌木，主要分布在云南省內(nèi)，且分布范圍較小而集中，大部分分布于滇東南地區(qū)的文山州境內(nèi)，在玉溪和紅河以及臨滄也有少量分布。大喇叭杜鵑花大而密集，花形獨(dú)特，具有較高的觀賞價(jià)值，是培育高山杜鵑大花品種的優(yōu)良親本資源[4-5]?；ǚ刍盍χ苯优c育種效率有關(guān)，而杜鵑花花粉活力及其貯藏方法的研究是開(kāi)展高山杜鵑良種培育的前提。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，不同植物的花粉萌發(fā)條件不盡相同[6]，如蘋(píng)果屬（Malus）植物花粉在pH值 4.0～9.0之間都能正常萌發(fā)[7]；Holdaway-Clarke 等研究發(fā)現(xiàn)，臺(tái)灣百合花粉的萌發(fā)與生長(zhǎng)都會(huì)受外源pH值變化的影響[8]。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)大喇叭杜鵑花粉的萌發(fā)條件及貯藏方法的相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)大喇叭杜鵑花粉的萌發(fā)溫度、pH值、貯藏溫度及其貯藏時(shí)間進(jìn)行研究，擬探討大喇叭杜鵑花粉萌發(fā)所需的條件，了解其花粉的貯藏耐性，旨在解決花期不遇、異地授粉等雜交中的實(shí)際困難，為高山杜鵑的雜交育種提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，試驗(yàn)材料大喇叭杜鵑花粉采自云南省麻栗坡縣下金廠鄉(xiāng)干壩子，地理位置23°07′27.58″N、104°49′21.70″E，海拔1 858～1 891 m。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1花粉粒的收集于散粉前采集大喇叭杜鵑的花藥，采用陰干法置于硅膠中干燥24～48 h，見(jiàn)花粉粒分離開(kāi)時(shí)采集花粉。

1.2.2花粉生活力的測(cè)定采用花粉離體萌發(fā)法測(cè)定花粉的生活力，離體培養(yǎng)法的培養(yǎng)基配方為50 g/L蔗糖+50 mg/L硼酸+50 mg/L氯化鈣+0.7%瓊脂。用玻璃棒加1～2滴培養(yǎng)液于載玻片上，稍冷卻后用干凈的毛筆蘸取少許花粉均勻撒播于培養(yǎng)基表面，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，黑暗條件下培養(yǎng)6 h后觀察花粉萌發(fā)情況。每個(gè)處理設(shè)4次重復(fù)（即培養(yǎng)4個(gè)載玻片），每個(gè)重復(fù)選取2個(gè)隨機(jī)視野（本試驗(yàn)采用200倍視野），每個(gè)視野中應(yīng)不少于50粒花粉，記錄發(fā)芽率，相關(guān)計(jì)算公式如下。

發(fā)芽率=視野內(nèi)已發(fā)芽的花粉數(shù)/視野內(nèi)的花粉粒總數(shù)×100%。

1.2.3不同溫度條件對(duì)花粉萌發(fā)率的影響在5、10、15、20、25、30、35、40 ℃條件下培養(yǎng)大喇叭杜鵑花粉。6 h后在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率，比較不同溫度條件下花粉萌發(fā)率的差異。

1.2.4外源pH值梯度的設(shè)定采用花粉培養(yǎng)基（測(cè)定pH值為5.6），用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl對(duì)培養(yǎng)基的pH值進(jìn)行梯度調(diào)節(jié)，分別設(shè)pH值為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、60、6.5、7.0、7.5。

1.2.5不同貯藏條件及不同貯藏時(shí)間下花粉萌發(fā)力的測(cè)定將干燥后的花粉分別裝入45個(gè)1.5 mL的離心管中，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。為了避免濕度的影響，在離心管中預(yù)先鋪1層扇形的吸水紙，并采用以下3種方法密封保存大喇叭杜鵑花粉：常溫保存、4 ℃冰箱保存、-18 ℃冰箱保存。從花粉貯藏起開(kāi)始，每隔一定時(shí)間（1、2、4、5、6個(gè)月）定期檢測(cè)花粉萌發(fā)率。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用DPS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行最小差異法（LSD）分析（P<0.05）。

2結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)溫度對(duì)大喇叭杜鵑花粉萌發(fā)的影響

由圖1-A可以看出，培養(yǎng)溫度在5～15 ℃時(shí)，花粉萌發(fā)率幾乎為0；當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到20 ℃時(shí)，花粉萌發(fā)數(shù)量急劇升高，萌發(fā)率達(dá)到48.9%；當(dāng)培養(yǎng)溫度在25 ℃時(shí)，花粉萌發(fā)率達(dá)到最大值，為87.0%；當(dāng)培養(yǎng)溫度進(jìn)一步升高，花粉萌發(fā)率開(kāi)始下降，30 ℃時(shí)的萌發(fā)率為60%，35 ℃時(shí)的萌發(fā)率下降到408%，而當(dāng)培養(yǎng)溫度高達(dá)40 ℃時(shí)，萌發(fā)率降為0。說(shuō)明培養(yǎng)溫度對(duì)大喇叭杜鵑花粉萌發(fā)的影響較大，最適培養(yǎng)溫度為25 ℃。

2.2pH值對(duì)大喇叭杜鵑花粉萌發(fā)的影響

由圖1-B可以看出，花粉在pH值為4.0～6.0的條件下能正常萌發(fā)，其萌發(fā)率在40%～87%之間；而當(dāng)pH值為極酸的35和中性偏堿的6.5～7.5時(shí)，大喇叭杜鵑花粉均不會(huì)萌發(fā)，其萌發(fā)率為0；當(dāng)pH值在4.0～5.5時(shí)，大喇叭杜鵑花粉的萌發(fā)率均能達(dá)到69%以上，且當(dāng)pH值為4.5時(shí)，其花粉萌發(fā)率達(dá)到最大值，為87%。說(shuō)明大喇叭杜鵑花粉對(duì)pH值較為敏感，在過(guò)度偏酸和中性偏堿的培養(yǎng)件條件下，其花粉均不能萌發(fā)。endprint

2.3貯藏方式對(duì)大喇叭杜鵑花粉萌發(fā)的影響

貯藏前的大喇叭杜鵑花粉有較高的生命力，其花粉萌發(fā)率達(dá)91.7%，適宜授粉。從表1可以看出，在室溫、4 ℃、-18 ℃ 等3種貯藏條件下，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，大喇叭杜鵑花粉的萌發(fā)率均降低，并且以室溫條件下的花粉萌發(fā)率下降得最快。室溫貯藏1個(gè)月后，花粉萌發(fā)率降低至581%，貯藏2個(gè)月后為37.6%，4個(gè)月后其花粉萌發(fā)率已降為46%，6個(gè)月時(shí)已降為0；4 ℃條件下，其花粉萌發(fā)率的降低速度相對(duì)緩慢，貯藏2個(gè)月后的花粉萌發(fā)率為68.7%，貯藏4、5個(gè)月后的花粉萌發(fā)率分別為12.2%、21.3%，而6個(gè)月后則降至1.4%；-18 ℃下的花粉貯藏效果最好，貯藏1個(gè)月后的花粉萌發(fā)率與新鮮花粉相當(dāng)，達(dá)90.1%，至4個(gè)月時(shí)其萌發(fā)率依然大于60.0%，貯藏5、6個(gè)月后的花粉萌發(fā)率分別為47.3%、15.0%。

3結(jié)論與討論

花粉是植物有性繁殖進(jìn)行遺傳物質(zhì)傳遞的載體，其活力直接影響傳遞的成敗。因此在進(jìn)行授粉之前，首先要對(duì)花粉的活力進(jìn)行檢測(cè)?；ǚ鄣纳盍σ蚱贩N而異，并且隨著外界的影響（溫度、濕度、輻射、貯藏條件）而變化。Wolukau等認(rèn)為，梅花花粉的最佳培養(yǎng)溫度為25 ℃[9]；Burke等認(rèn)為，棉花花粉的適宜的培養(yǎng)溫度為20～37 ℃[10]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度對(duì)大喇叭杜鵑花粉的萌發(fā)生長(zhǎng)有明顯影響，其花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)溫度為25 ℃，過(guò)高的培養(yǎng)溫度則會(huì)抑制花粉萌發(fā)。

本試驗(yàn)結(jié)果還表明，在pH值為4.0～6.0的條件下，大喇叭杜鵑花粉能正常萌發(fā)生長(zhǎng)，且萌發(fā)率達(dá)到40%以上，最大萌發(fā)率為87%，當(dāng)pH值在3.5或6.0～7.5時(shí)，花粉就不能萌發(fā)，最適合大喇叭杜鵑花粉萌發(fā)的pH值為4.5。這與蘋(píng)果屬花粉、甜橙花粉等極不相同，蘋(píng)果屬、甜橙等植物的花粉在pH值為4.0～9.0之間都能夠正常萌發(fā)，甜橙花粉最適的pH值為6.0～7.0[11]；而七子花在pH值為5.5～8.0條件下均能萌發(fā)，最適 pH值為7，強(qiáng)酸或強(qiáng)堿條件均不利于大部分植物離體花粉的萌發(fā)與生長(zhǎng)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，大喇叭杜鵑的花粉在強(qiáng)酸下最適合萌發(fā)，這與其實(shí)際的生長(zhǎng)環(huán)境極其相關(guān)。

影響花粉壽命的關(guān)鍵因素是花粉含水量和貯藏溫度，低溫、干燥處理是長(zhǎng)期保存花粉的必要條件[13-15]。有研究表明，將不同品種的飛燕草花粉干燥并貯藏在-30 ℃條件下，經(jīng)過(guò)180 d后仍然保持較高的萌發(fā)率和較長(zhǎng)的花粉管[16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，大喇叭杜鵑花粉的萌發(fā)率逐漸下降；適當(dāng)?shù)牡蜏刭A藏有利于延長(zhǎng)大喇叭杜鵑花粉的壽命，貯藏在-18 ℃下的花粉經(jīng)過(guò)1個(gè)月后仍然保持90.1%的萌發(fā)率，與貯藏前花粉的萌發(fā)率（91.7%）相比僅僅下降了1.6百分點(diǎn)?？傮w看來(lái)，低溫保存是目前植物種質(zhì)資源保存中較理想的途徑，低溫貯藏的大喇叭杜鵑花粉可直接用于雜交育種中進(jìn)行授粉，從而為進(jìn)一步培育新品種奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，也為將來(lái)用超低溫保存技術(shù)對(duì)其長(zhǎng)期保存作了基礎(chǔ)性的技術(shù)保障。

參考文獻(xiàn)：

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[16]Honda K，Watanabe H，Tsutsui K. Cryopreservation of Delphinium pollen at -30 ℃[J]. Euphytica，2002，126（3）：315-320.endprint

2.3貯藏方式對(duì)大喇叭杜鵑花粉萌發(fā)的影響

貯藏前的大喇叭杜鵑花粉有較高的生命力，其花粉萌發(fā)率達(dá)91.7%，適宜授粉。從表1可以看出，在室溫、4 ℃、-18 ℃ 等3種貯藏條件下，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，大喇叭杜鵑花粉的萌發(fā)率均降低，并且以室溫條件下的花粉萌發(fā)率下降得最快。室溫貯藏1個(gè)月后，花粉萌發(fā)率降低至581%，貯藏2個(gè)月后為37.6%，4個(gè)月后其花粉萌發(fā)率已降為46%，6個(gè)月時(shí)已降為0；4 ℃條件下，其花粉萌發(fā)率的降低速度相對(duì)緩慢，貯藏2個(gè)月后的花粉萌發(fā)率為68.7%，貯藏4、5個(gè)月后的花粉萌發(fā)率分別為12.2%、21.3%，而6個(gè)月后則降至1.4%；-18 ℃下的花粉貯藏效果最好，貯藏1個(gè)月后的花粉萌發(fā)率與新鮮花粉相當(dāng)，達(dá)90.1%，至4個(gè)月時(shí)其萌發(fā)率依然大于60.0%，貯藏5、6個(gè)月后的花粉萌發(fā)率分別為47.3%、15.0%。

3結(jié)論與討論

花粉是植物有性繁殖進(jìn)行遺傳物質(zhì)傳遞的載體，其活力直接影響傳遞的成敗。因此在進(jìn)行授粉之前，首先要對(duì)花粉的活力進(jìn)行檢測(cè)?；ǚ鄣纳盍σ蚱贩N而異，并且隨著外界的影響（溫度、濕度、輻射、貯藏條件）而變化。Wolukau等認(rèn)為，梅花花粉的最佳培養(yǎng)溫度為25 ℃[9]；Burke等認(rèn)為，棉花花粉的適宜的培養(yǎng)溫度為20～37 ℃[10]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度對(duì)大喇叭杜鵑花粉的萌發(fā)生長(zhǎng)有明顯影響，其花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)溫度為25 ℃，過(guò)高的培養(yǎng)溫度則會(huì)抑制花粉萌發(fā)。

本試驗(yàn)結(jié)果還表明，在pH值為4.0～6.0的條件下，大喇叭杜鵑花粉能正常萌發(fā)生長(zhǎng)，且萌發(fā)率達(dá)到40%以上，最大萌發(fā)率為87%，當(dāng)pH值在3.5或6.0～7.5時(shí)，花粉就不能萌發(fā)，最適合大喇叭杜鵑花粉萌發(fā)的pH值為4.5。這與蘋(píng)果屬花粉、甜橙花粉等極不相同，蘋(píng)果屬、甜橙等植物的花粉在pH值為4.0～9.0之間都能夠正常萌發(fā)，甜橙花粉最適的pH值為6.0～7.0[11]；而七子花在pH值為5.5～8.0條件下均能萌發(fā)，最適 pH值為7，強(qiáng)酸或強(qiáng)堿條件均不利于大部分植物離體花粉的萌發(fā)與生長(zhǎng)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，大喇叭杜鵑的花粉在強(qiáng)酸下最適合萌發(fā)，這與其實(shí)際的生長(zhǎng)環(huán)境極其相關(guān)。

影響花粉壽命的關(guān)鍵因素是花粉含水量和貯藏溫度，低溫、干燥處理是長(zhǎng)期保存花粉的必要條件[13-15]。有研究表明，將不同品種的飛燕草花粉干燥并貯藏在-30 ℃條件下，經(jīng)過(guò)180 d后仍然保持較高的萌發(fā)率和較長(zhǎng)的花粉管[16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，大喇叭杜鵑花粉的萌發(fā)率逐漸下降；適當(dāng)?shù)牡蜏刭A藏有利于延長(zhǎng)大喇叭杜鵑花粉的壽命，貯藏在-18 ℃下的花粉經(jīng)過(guò)1個(gè)月后仍然保持90.1%的萌發(fā)率，與貯藏前花粉的萌發(fā)率（91.7%）相比僅僅下降了1.6百分點(diǎn)?？傮w看來(lái)，低溫保存是目前植物種質(zhì)資源保存中較理想的途徑，低溫貯藏的大喇叭杜鵑花粉可直接用于雜交育種中進(jìn)行授粉，從而為進(jìn)一步培育新品種奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，也為將來(lái)用超低溫保存技術(shù)對(duì)其長(zhǎng)期保存作了基礎(chǔ)性的技術(shù)保障。

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[16]Honda K，Watanabe H，Tsutsui K. Cryopreservation of Delphinium pollen at -30 ℃[J]. Euphytica，2002，126（3）：315-320.endprint

2.3貯藏方式對(duì)大喇叭杜鵑花粉萌發(fā)的影響

貯藏前的大喇叭杜鵑花粉有較高的生命力，其花粉萌發(fā)率達(dá)91.7%，適宜授粉。從表1可以看出，在室溫、4 ℃、-18 ℃ 等3種貯藏條件下，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，大喇叭杜鵑花粉的萌發(fā)率均降低，并且以室溫條件下的花粉萌發(fā)率下降得最快。室溫貯藏1個(gè)月后，花粉萌發(fā)率降低至581%，貯藏2個(gè)月后為37.6%，4個(gè)月后其花粉萌發(fā)率已降為46%，6個(gè)月時(shí)已降為0；4 ℃條件下，其花粉萌發(fā)率的降低速度相對(duì)緩慢，貯藏2個(gè)月后的花粉萌發(fā)率為68.7%，貯藏4、5個(gè)月后的花粉萌發(fā)率分別為12.2%、21.3%，而6個(gè)月后則降至1.4%；-18 ℃下的花粉貯藏效果最好，貯藏1個(gè)月后的花粉萌發(fā)率與新鮮花粉相當(dāng)，達(dá)90.1%，至4個(gè)月時(shí)其萌發(fā)率依然大于60.0%，貯藏5、6個(gè)月后的花粉萌發(fā)率分別為47.3%、15.0%。

3結(jié)論與討論

花粉是植物有性繁殖進(jìn)行遺傳物質(zhì)傳遞的載體，其活力直接影響傳遞的成敗。因此在進(jìn)行授粉之前，首先要對(duì)花粉的活力進(jìn)行檢測(cè)。花粉的生活力因品種而異，并且隨著外界的影響（溫度、濕度、輻射、貯藏條件）而變化。Wolukau等認(rèn)為，梅花花粉的最佳培養(yǎng)溫度為25 ℃[9]；Burke等認(rèn)為，棉花花粉的適宜的培養(yǎng)溫度為20～37 ℃[10]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度對(duì)大喇叭杜鵑花粉的萌發(fā)生長(zhǎng)有明顯影響，其花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)溫度為25 ℃，過(guò)高的培養(yǎng)溫度則會(huì)抑制花粉萌發(fā)。

本試驗(yàn)結(jié)果還表明，在pH值為4.0～6.0的條件下，大喇叭杜鵑花粉能正常萌發(fā)生長(zhǎng)，且萌發(fā)率達(dá)到40%以上，最大萌發(fā)率為87%，當(dāng)pH值在3.5或6.0～7.5時(shí)，花粉就不能萌發(fā)，最適合大喇叭杜鵑花粉萌發(fā)的pH值為4.5。這與蘋(píng)果屬花粉、甜橙花粉等極不相同，蘋(píng)果屬、甜橙等植物的花粉在pH值為4.0～9.0之間都能夠正常萌發(fā)，甜橙花粉最適的pH值為6.0～7.0[11]；而七子花在pH值為5.5～8.0條件下均能萌發(fā)，最適 pH值為7，強(qiáng)酸或強(qiáng)堿條件均不利于大部分植物離體花粉的萌發(fā)與生長(zhǎng)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，大喇叭杜鵑的花粉在強(qiáng)酸下最適合萌發(fā)，這與其實(shí)際的生長(zhǎng)環(huán)境極其相關(guān)。

影響花粉壽命的關(guān)鍵因素是花粉含水量和貯藏溫度，低溫、干燥處理是長(zhǎng)期保存花粉的必要條件[13-15]。有研究表明，將不同品種的飛燕草花粉干燥并貯藏在-30 ℃條件下，經(jīng)過(guò)180 d后仍然保持較高的萌發(fā)率和較長(zhǎng)的花粉管[16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，大喇叭杜鵑花粉的萌發(fā)率逐漸下降；適當(dāng)?shù)牡蜏刭A藏有利于延長(zhǎng)大喇叭杜鵑花粉的壽命，貯藏在-18 ℃下的花粉經(jīng)過(guò)1個(gè)月后仍然保持90.1%的萌發(fā)率，與貯藏前花粉的萌發(fā)率（91.7%）相比僅僅下降了1.6百分點(diǎn)?？傮w看來(lái)，低溫保存是目前植物種質(zhì)資源保存中較理想的途徑，低溫貯藏的大喇叭杜鵑花粉可直接用于雜交育種中進(jìn)行授粉，從而為進(jìn)一步培育新品種奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，也為將來(lái)用超低溫保存技術(shù)對(duì)其長(zhǎng)期保存作了基礎(chǔ)性的技術(shù)保障。

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