混合型肝癌組織中OV6與Snail蛋白的表達及臨床意義

張旭光, 王 杰, 李 權(quán), 吳 東

(1. 蘇州大學研究生院, 江蘇 蘇州, 215006; 2. 東方肝膽外科醫(yī)院, 上海, 200438)

混合型肝癌(cHCC-CC)在原發(fā)肝癌中是一個罕見的病理亞型，約占總發(fā)病人數(shù)1.5%[1-2]。雖然相對罕見，但由于其獨特的臨床病理學特征而吸引了廣泛關(guān)注。OV6作為肝祖細胞的標記物，能夠增加腫瘤的化療耐藥性[3]。Snail是一種含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄抑制因子，同時也是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的重要調(diào)節(jié)因子，能夠促進腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。本研究采用免疫組織化學法檢測OV6和Snail蛋白在混合型肝癌組織中的表達，探討其與混合型肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及臨床病理學意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取1997年2月—2003年7月在本院確診為混合型肝癌并進行根治性切除的患者70例，其中男63例，女7例，平均年齡48.1歲；乙肝表面抗原(HBsAg)陽性58例(82.8%), 陰性12例(17.2%); 腫瘤平均直徑為6.1 cm。標本均經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋和4 μm厚連續(xù)切片。鼠抗人OV6單克隆抗體購于R﹠D公司，兔抗人Snail多克隆抗體購于Abcam公司。

1.2 免疫組織化學方法

對已制作好的切片常規(guī)脫蠟水化, 3%過氧化氫甲醇溶液放置10 min, 微波熱修復。加入用血清稀釋液稀釋的一抗(OV6為1∶40; Snail為1∶200), 4 ℃孵育16～22 h; 吸去抗體, 0.01 mol/L PBS緩沖液清洗3次, 5 min/次；加入PBS稀釋的二抗，37 ℃孵育30 min; 加入顯色液進行顯色，用蒸餾水終止反應；梯度乙醇脫水，封片。

1.3 陽性判定標準

OV6蛋白陽性表達于細胞質(zhì), Snail蛋白陽性表達于細胞核，隨機取5個高倍鏡視野計數(shù), OV6的評估以陽性染色面積及強度作為判定結(jié)果[4]。無色、淡黃色(<5%)為陰性染色；棕黃色(5%～30%), 棕褐色(>30%)為陽性染色。Snail的評估以陽性細胞核的面積作為判定結(jié)果[5]。0: 無染色; +: 1%～25%; 2+: 26%～50%; 3+: >50%, 3+定義為陽性染色。

1.4 統(tǒng)計學方法

對分類變量用卡方檢驗或Fisher確切概率法，使用Kaplan-Meier分析法計算總生存和無瘤生存率并繪制生存曲線，組間對比用log-rank法。采用spearman做相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，所有統(tǒng)計學計算通過SPSS 18.0完成。

2 結(jié) 果

2.1 OV6和Snail在混合型肝癌組織中的表達情況

OV6蛋白陽性定位于胞漿，呈棕黃或棕褐色(圖1)，陽性表達率為42.8%(30/70)。Snail蛋白陽性定位于細胞核(圖2), 陽性表達率為47.1%(33/70)。

B. 陰性染色

A. 陽性染色

B. 陰性染色

2.2 OV6和Snail蛋白表達與臨床病理學因素的關(guān)系及相關(guān)性分析

在混合型肝癌組織中, OV6和Snail蛋白表達與腫瘤數(shù)目、血AFP水平和微血管侵犯均相關(guān)(P<0.05); 而與乙肝表面抗原、腫瘤大小、肝硬化和TNM分期均無關(guān)(P>0.05), 見表1。OV6和Snail蛋白的表達呈正相關(guān)(r=0.270,P<0.05)，見表2。

表1 OV6和Snail蛋白表達與臨床病理學因素的關(guān)系[n(%)]

表2 OV6和Snail蛋白在混合型肝癌組織中的相關(guān)性分析

2.3 OV6和Snail蛋白表達與預后的關(guān)系

利用Kaplan-Meier分析法, OV6和Snail蛋白表達影響患者術(shù)后總體生存率(P<0.05), OV6蛋白表達與術(shù)后無瘤生存率無相關(guān)性(P>0.05), 而Snail蛋白表達影響患者術(shù)后無瘤生存率(P<0.05)，見圖3、4。

圖3 OV6表達與預后的關(guān)系(A: P>0.05;B: P<0.05)

圖4 Snail表達與預后的關(guān)系(A、B: P<0.05)

3 討 論

混合型肝癌是一種罕見的肝臟惡性腫瘤，由于其發(fā)生率低，因此對其臨床特點、診斷及治療方面缺乏深刻認識。越來越多的研究[6-7]發(fā)現(xiàn)肝癌干細胞標志物，如OV6、Epcam、AFP等。卵圓細胞標記物OV6陽性的肝癌細胞具有更高的體內(nèi)成瘤能力和化療耐受性，從而有助于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究也發(fā)現(xiàn)在混合型肝癌組織中OV6陽性表達的患者術(shù)后總體生存率低于表達陰性的。OV6蛋白表達與腫瘤數(shù)目、血AFP水平及微血管侵犯呈正相關(guān)。與文獻[4，8]報道基本一致。Wen Yang等[3]研究也發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中OV6高表達影響患者總體生存和無瘤生存率。Snail基因超家族是一種含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄抑制因子，包括Snail1、Snail2(Slug)和SIP1等，同時也是EMT的重要調(diào)節(jié)因子，其與E-cadherin啟動子區(qū)E-box結(jié)合而抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，從而促進腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[9-10]。近年來大量研究報道，Snail在促進腫瘤侵襲過程中獲得腫瘤干細胞特性，從而促進許多惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和復發(fā)。本研究也發(fā)現(xiàn)Snail陽性表達的患者術(shù)后總體生存率和無瘤生存率明顯低于陰性表達，其在混合型肝癌組織中的表達與腫瘤數(shù)目、血AFP水平及微血管侵犯呈正相關(guān)。這提示了Snail在混合型肝癌的發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移中可能起著重要的作用，與文獻[5，11]報道基本一致。大量文獻[12-14]報道肝癌干細胞的激活與EMT的轉(zhuǎn)錄因子之間存在相關(guān)性。Kim H等報道[11]在肝癌組織中通過免疫組化和mRNA水平檢測發(fā)現(xiàn)包括Snail和Slug在內(nèi)的誘導EMT的因子與K19的表達呈正相關(guān)，同時發(fā)現(xiàn)CD133表達與E-cadherin下調(diào)相關(guān)，并影響患者預后。這些結(jié)果進一步證實Snail家族作為誘導EMT的轉(zhuǎn)錄抑制因子可獲得腫瘤干性特征，促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。目前關(guān)于OV6和Snail蛋白在腫瘤演變中的相互關(guān)系未見報道。本研究結(jié)果表明, OV6與Snail蛋白在混合型肝癌組織中的表達呈正相關(guān)(r=0.270，P<0.05)，且隨著腫瘤數(shù)目、血AFP水平及微血管侵犯的增加，兩者的表達率均升高。提示了OV6與Snail可能通過某些共同的途徑在混合型肝癌的發(fā)生及侵襲中發(fā)揮協(xié)同作用，但其機制尚不清楚，有待研究。

綜上所述，混合型肝癌是原發(fā)肝癌中少見的病理類型，臨床表現(xiàn)不典型，影像學檢查表現(xiàn)多變，術(shù)前診斷困難。聯(lián)合檢測OV6和Snail蛋白對混合型肝癌的診斷及預后判斷有一定臨床意義。

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