長春地區(qū)奶牛乳腺炎主要致病菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

劉春杰 楊麗華 張春 劉靚 王貴 李景思

摘 要 試驗(yàn)旨在研究長春地區(qū)奶牛乳腺炎主要病原菌的種類、分離鑒定和藥敏試驗(yàn)，初步探討了奶牛乳腺炎的發(fā)病原因及防治措施。隨機(jī)選擇長春周邊地區(qū)不同泌乳期黑白花奶牛50頭，按常規(guī)擠奶消毒，以被檢乳區(qū)為單位進(jìn)行采樣。對乳樣中細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，鑒定主要致病菌，并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果表明：乳樣中分離到3種主要病原菌，其中金黃色葡萄球菌占分離菌株的67.35%；大腸桿菌占24.49%；鏈球菌占8.16%。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明分離到的主要病原菌對氨芐青霉素不敏感，近100%耐藥。金黃色葡萄球菌和鏈球菌對四環(huán)素、痢特靈、紅霉素產(chǎn)生耐藥性；大腸桿菌對先鋒霉素Ⅵ和環(huán)丙沙星敏感性較高。結(jié)論：在治療奶牛乳腺炎時(shí)應(yīng)盡量交叉用藥，防止產(chǎn)生耐藥性，并努力開辟新的預(yù)防和治療方法。

關(guān)鍵詞 奶牛；乳腺炎；病原菌；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)；長春地區(qū)

中圖分類號：S858.23 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：

奶牛乳腺炎是一種復(fù)雜的、造成奶牛業(yè)經(jīng)濟(jì)損失最嚴(yán)重的疾病之一。該病從發(fā)現(xiàn)至今已有150多a的歷史。根據(jù)世界奶牛協(xié)會公布的數(shù)據(jù)顯示，全球約有50%左右奶?；加腥橄傺祝磕暌蛉橄傺自蚴古Ｄ坍a(chǎn)量降低達(dá)380萬 t。我國奶牛乳腺炎的發(fā)病率平均為70%左右，明顯高于世界平均水平，且每頭奶牛平均減少奶量約為10%～15%。此外，治療奶牛奶牛乳腺炎的醫(yī)藥費(fèi)數(shù)量也相當(dāng)巨大。據(jù)報(bào)道，在美國治療臨床型乳腺炎每頭奶牛約需37.96美元，而我國每例乳腺炎平均需醫(yī)藥費(fèi)23元[1]。除此外，乳腺炎的發(fā)生還會使奶牛產(chǎn)后發(fā)情和妊娠時(shí)間延長，牛奶營養(yǎng)成份下降以及對人類的健康造成危害，這些都是無法估計(jì)的巨大損失。奶牛乳腺炎的發(fā)病原因多種多樣，但大多數(shù)是由病原微生物引起的[2]，其病原種類具有顯著的地域性，由此，就長春地區(qū)引起奶牛乳腺炎的病原菌進(jìn)行分離鑒定并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，為開發(fā)研制治療奶牛乳腺炎的藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌、大腸桿菌購于ATCC。試驗(yàn)用瓊脂粉、牛肉浸膏、蛋白胨、水解酪蛋白、可溶性淀粉、甘露醇等均為分析純。MH瓊脂、MH肉湯、綿羊血瓊脂平板、和標(biāo)準(zhǔn)比濁管等按有關(guān)文獻(xiàn)配制[3]。糖發(fā)酵管等生化鑒定所用的微量發(fā)酵管和部分藥敏試紙片購自杭州微生物試劑有限公司，部分藥敏紙片按常規(guī)方法自制。

1.2 試驗(yàn)儀器

ZSD-A1090，上海智誠生化培養(yǎng)箱、HS-840U，蘇州凈化設(shè)備有限公司超凈工作臺；4℃冰箱青島海爾BCD-215KS；BSA-224S電子天平，德國賽多利斯；日本三洋立式高壓滅菌鍋MLS-3780，；上海新苗DNP-9162BS-III 數(shù)顯式鼓風(fēng)干燥箱。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乳樣采集

在長春周邊地區(qū)幾個(gè)奶牛場隨機(jī)挑選60頭處于不同泌乳期的荷斯坦奶牛進(jìn)行乳采集，奶牛按常規(guī)擠奶方法，每日人工擠奶2次，以被檢乳區(qū)為單位進(jìn)行采樣。用溫?zé)岬臐衩聿胂慈榉?，將擠奶員的手指和奶牛乳頭用碘伏消毒，再用75%酒精棉球脫碘。采集乳樣前頭2～3把奶棄去，采用無菌操作手法，每個(gè)乳室取乳樣5～6 mL置于滅菌青霉素藥瓶中，加蓋密封，標(biāo)明采樣日期、牛號、乳室等，迅速將乳樣置于冰袋上帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和有關(guān)檢測試驗(yàn)[4-5]。

1.3.2 分離培養(yǎng)細(xì)菌

將分裝于青瓶中無菌采集的乳樣搖勻，在無菌環(huán)境下用接菌環(huán)劃線接種于綿羊血瓊脂、伊紅-美蘭瓊脂、麥康凱瓊脂、甘露醇瓊脂平板上，做上標(biāo)記，置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24～48h后觀察菌落形態(tài)。對可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色涂片，鏡檢。對呈現(xiàn)革蘭氏陽性和陰性菌按常規(guī)方法分別進(jìn)行純培養(yǎng)。將鏡檢無雜菌的菌落接種于血瓊脂斜面上，37℃恒溫培養(yǎng)18～24h后4℃保存，用于鑒定。

1.3.3 致病菌鑒定

1.3.3.1 形態(tài)學(xué)觀察

根據(jù)細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長形態(tài)、生長特征和鏡檢結(jié)果等情況，將分離出來的菌進(jìn)行初步劃分，分為葡萄球菌、鏈球菌、腸桿菌屬，為進(jìn)一步生化鑒定初步確定鑒定項(xiàng)目[6-7]。

2.1.2.2 生化鑒定

將純培養(yǎng)分離的細(xì)菌進(jìn)行涂片染色鏡檢，以檢驗(yàn)其純度。采用細(xì)菌觸酶試驗(yàn)、兔血漿凝固酶試驗(yàn)、甘露醇發(fā)酵生化鑒定管等進(jìn)行鑒定疑似葡萄球菌屬細(xì)菌；采用三糖鐵、吲哚、甲基紅、V-P、枸櫞酸鹽發(fā)酵試驗(yàn)等進(jìn)行鑒定疑似大腸桿菌屬細(xì)菌[8-9]。

1.3.4 藥敏試驗(yàn)

采用臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）推薦的標(biāo)準(zhǔn)，利用瓊脂紙片擴(kuò)散法，檢測分離得到的3類細(xì)菌對四環(huán)素、紅霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、青霉素、痢特靈與先鋒霉素Ⅵ等幾種藥敏紙片的敏感度。用卡尺測量抑菌圈直徑（φ），φ大于15 mm為極敏感；10 mm>φ>15 mm為高度敏感；10 mm>φ>8 mm 為敏感；φ>8 mm為不敏感[10]。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果

本試驗(yàn)共采集乳樣100份，進(jìn)行樣品中病原菌的細(xì)菌分離培養(yǎng)，分別獲得3種主要病原菌共98株，金黃色葡萄球菌66株，占分離株的67.35%；大腸桿菌24株，占分離株的24.49%；無乳鏈球菌8株，占分離株的8.16%（見表1）。

2.2 生化鑒定結(jié)果

根據(jù)鏡檢觀察的菌落形態(tài)特征，將對疑似葡萄球菌和大腸桿菌菌落，進(jìn)行增菌后純化培養(yǎng)，將純培養(yǎng)菌落進(jìn)行生化鑒定。將鏡檢結(jié)果與各株細(xì)菌培養(yǎng)特性分析后，確定分離到的菌株為金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌[11]、大腸桿菌和克雷伯氏菌[12]。

2.3 藥物敏感試驗(yàn)

采用藥敏試驗(yàn)，將通過生化鑒定的98株細(xì)菌分別進(jìn)行試驗(yàn)，依據(jù)CLSI的藥敏判定標(biāo)準(zhǔn)，比較各株細(xì)菌抑菌圈直徑大小。結(jié)果顯示分離到的3種主要病原菌對氨芐青霉素完全不敏感，幾乎100%耐藥。金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌對四環(huán)素，痢特靈，紅霉素有一定耐藥性；多數(shù)抗菌素對大腸桿菌也缺乏抗菌作用。但多數(shù)菌株對先鋒霉素Ⅵ和環(huán)丙沙星較敏感，尤其對頭孢拉定的敏感程度最高，接近100%（見表2）。

3 小結(jié)與討論

從乳樣中分離鑒定得到的3種細(xì)菌可知，引發(fā)奶牛乳腺炎的主要致病菌可能是金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌，此3種菌引起的乳腺炎占全部乳腺炎發(fā)病率的80%以上，這與以前有關(guān)報(bào)道相符[5，13，14]。從有關(guān)文獻(xiàn)可知，奶牛乳腺炎病原菌的分布具有顯著地域性，長春地區(qū)主要致病菌為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌[15]。其中金黃色葡萄球菌為優(yōu)勢菌群，這與國內(nèi)外有關(guān)報(bào)道相同[16]。因此，根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r研究中西藥對幾種主要病原菌的體內(nèi)外抑菌活性具有重要意義。

當(dāng)今，在奶牛乳腺炎的治療與防控中抗生素起了重要作用。但抗生素的長期使用，使得耐藥菌株大量產(chǎn)生，以前常用抗生素不再具有強(qiáng)勁的抑菌作用。從本試驗(yàn)可知，誘發(fā)奶牛乳腺炎的3種主要致病菌對常用的青霉素類、紅霉素類和慶大霉素類等抗生素均存在不同程度的耐藥性，尤其長期使用青霉素類抗生素，使菌株產(chǎn)生了完全耐藥性，這與牛場長期應(yīng)用青霉素類藥物治療乳腺炎感染有關(guān)。因此，青霉素類藥物在臨床治療奶牛乳腺炎方面療效下降，基于此在治療藥物的選擇方面應(yīng)選擇對3種菌株敏感性高的藥物，如先鋒霉素Ⅵ、環(huán)丙沙星等。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，一些廣譜抗生素的抗菌療效較好，這與本試驗(yàn)結(jié)果中病原菌對氨基糖苷類抗生素慶大霉素及喹諾酮類抗生素環(huán)丙沙星藥敏的結(jié)果相符合。但試驗(yàn)中最敏感的藥物是先鋒霉素Ⅵ，但根據(jù)臨床上選擇治療藥物的有關(guān)原則以及綜合考慮藥物對細(xì)菌的殺傷力、價(jià)格、耐藥性、毒副作用及安全性等因素后，首選氨基糖苷類藥物環(huán)丙沙星和喹諾酮類藥物慶大霉素用于長春地區(qū)奶牛乳腺炎治療。

但目前大量應(yīng)用抗生素后，出現(xiàn)的耐藥菌株數(shù)量增多，使防控奶牛乳腺炎難度增加，同時(shí)，對人類健康造成危害。為此，奶牛乳腺炎的治療應(yīng)采用交替用藥，防止產(chǎn)生耐藥菌株，嚴(yán)禁濫用抗生素，積極開拓創(chuàng)新治療方法，減少抗生素后對人類健康的危害，防止耐藥菌株的產(chǎn)生。由以上可知，在奶牛乳腺炎的治療中，必須貫徹“預(yù)防為主”的方針，創(chuàng)建完善的奶牛飼養(yǎng)管理制度，改善牛舍環(huán)境衛(wèi)生、訓(xùn)練擠奶員按規(guī)范程序操作和提高擠奶熟練度降低乳腺炎的發(fā)生率。

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（責(zé)任編輯：劉昀）