氣管內(nèi)滴入核仁素shRNA表達(dá)載體對(duì)脂多糖肺損傷大鼠肺泡巨噬細(xì)胞活化的影響

王 藝 徐劍鋮 毛 梅 李秋梅 田 靜 蘇 磊

肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophages,AM))是肺部炎癥反應(yīng)的主要始動(dòng)細(xì)胞，也是脂多糖(lipopolysacharide,LPS)的主要效應(yīng)細(xì)胞，其表面表達(dá)有多種模式識(shí)別受體可以識(shí)別結(jié)合LPS，啟動(dòng)跨膜和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，引起多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的釋放，從而導(dǎo)致過(guò)度炎癥反應(yīng)和急性肺損傷(acute lung injury，ALI)[1-3]。核仁素(nucleolin，由C23基因編碼)是真核細(xì)胞核仁中含量最豐富的一種蛋白質(zhì)，它是一種穿梭蛋白，可以自由穿梭于細(xì)胞核、細(xì)胞漿和細(xì)胞膜之間，具有多種生物學(xué)功能，參與了細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，并在病原微生物的感染和自身免疫系統(tǒng)疾病中也發(fā)揮一定的作用[4]。目前大量研究表明核仁素在單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)膜表面廣泛分布并且參與了LPS所致炎癥反應(yīng)[5-8]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)正常大鼠AM膜表面表達(dá)有核仁素，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其參與了LPS的內(nèi)化及對(duì)AM的激活，它可能是LPS的一種新的膜識(shí)別受體[9]。

本實(shí)驗(yàn)擬在體應(yīng)用RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)，通過(guò)氣管滴入的方法轉(zhuǎn)染針對(duì)核仁素的shRNA表達(dá)載體，干擾大鼠AM膜核仁素的表達(dá)，觀察其對(duì)LPS所致ALI大鼠的保護(hù)作用，為闡明AM膜核仁素在LPS誘導(dǎo)ALI中的作用及機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、試劑和動(dòng)物

成年清潔級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。重組質(zhì)粒pBS-U6.C23shRNA及對(duì)照質(zhì)粒pBS-U6.ControlshRNA由美國(guó)Ambion公司合成，jetPEITM轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自法國(guó)Polyplus-transfection公司，LPS(E coli O55:B5)購(gòu)自美國(guó)Sigma Invitrogen公司，大鼠TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒購(gòu)自晶美生物科技公司，抗鼠C23抗體、抗NF-κBp65抗體及PVDF膜購(gòu)自SantaCruz公司，蛋白定量BCA法試劑盒和細(xì)胞膜、細(xì)胞核蛋白提取試劑盒均為碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

健康雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分為A組(空白對(duì)照組)，B組(ALI組)，C組(轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pBS-U6.C23shRNA并ALI組)，D組(轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒pBS-U6.ControlshRNA并ALI組)，每組10只動(dòng)物。

三、氣管內(nèi)滴注轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒

將100 μg的重組質(zhì)粒pBS-U6.C23shRNA溶于300 μl的生理鹽水中，將200 μg的jetPEITM 溶于300 μl生理鹽水中，將二者混合迅速振蕩混勻溶液(共600 μl)，室溫下孵育20 min后抽入無(wú)菌1 ml注射器，待轉(zhuǎn)染。C組大鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于鼠板上，消毒切開(kāi)頸部皮膚，鈍性分離出氣管，將裝有質(zhì)粒DNA 1ml的注射器經(jīng)兩氣管軟骨環(huán)間隙穿刺進(jìn)入氣管，回抽無(wú)阻力并有空氣則證明在氣管內(nèi)，將轉(zhuǎn)染液體緩慢推入。推注完畢后，拔出注射器，立即將鼠板直立旋轉(zhuǎn)，使氣管內(nèi)的液體均勻分布至兩肺，最后消毒縫合切口，等待復(fù)蘇。蘇醒后的大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)待建立LPS致ALI的動(dòng)物模型。同法，將D組大鼠經(jīng)氣管內(nèi)滴入轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒pBS-U6.ControlshRNA 100 μg。

四、LPS致ALI模型建立

轉(zhuǎn)染48 h后，B、C、D組大鼠經(jīng)尾靜脈緩慢注射LPS(E coli O55:B5)5 mg/kg，A組大鼠經(jīng)尾靜脈緩慢注射生理鹽水，15 min注射完畢。觀察大鼠自主呼吸，實(shí)驗(yàn)在注射LPS 4 h后結(jié)束。

五、觀察指標(biāo)及方法

各組動(dòng)物致傷后4 h，做如下實(shí)驗(yàn)：①ELISA測(cè)定大鼠肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中TNF-α及IL-6的含量：無(wú)菌條件下收集BALF，按TNF-α及IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)BALF中TNF-α及IL-6蛋白的濃度，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)吸光值；②Western blot檢測(cè)AM膜核仁素蛋白表達(dá)：BALF離心沉淀用膜蛋白提取試劑提取AM膜蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，后分別加入5×SDS上樣緩沖液，沸水煮5 min，離心后取上清液上樣進(jìn)行聚丙烯凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)，電轉(zhuǎn)將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含50 g/L脫脂奶粉的封閉液封閉2 h，一抗(兔抗大鼠C23多克隆抗體，稀釋度1︰500)4 ℃孵育過(guò)夜，二抗(羊抗兔IgG/HRP，稀釋度1︰1000)37 ℃孵育1 h，洗膜后用化學(xué)發(fā)光試劑顯色；③EMSA檢測(cè)NF-κB活性：提取大鼠AM核蛋白，將核提取物、生物素標(biāo)記特異性探針和結(jié)合反應(yīng)液等混合制成結(jié)合反應(yīng)體系，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，應(yīng)用Quantity One圖像分析軟件測(cè)定各條帶積分光密度值表示核提取物中NF-KB的活性，同時(shí)進(jìn)行特異性與非特異性競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)；④左下肺組織固定后石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡觀察。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、肺組織病理學(xué)觀察

大鼠肺組織病理變化，見(jiàn)圖1。A組肺泡腔結(jié)構(gòu)、完整，無(wú)明顯病理變化，組間無(wú)顯著差異；B組肺泡結(jié)構(gòu)破壞明顯，部分肺泡腔變小，肺泡間隔增厚，間質(zhì)增生，可見(jiàn)較多的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；C組肺泡結(jié)構(gòu)仍有破壞，但較B組損傷有減輕，部分肺泡壁增厚，肺間質(zhì)增生減輕，浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞減少，與B組相比炎癥有減輕；而D組與B組病理變化無(wú)明顯差異。

注：A：對(duì)照組; B：LPS處理組;C：LPS+pBS-U6.C23 shRNA組;D：LPS+pBS-U6.ControlshRNA組

二、AM膜核仁素蛋白表達(dá)

經(jīng)LPS處理后，B組及D組的大鼠AM膜核仁素蛋白表達(dá)顯著增加，與A組相比，組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；C組大鼠AM膜核仁素蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，與B組相比，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而D組與B組中的大鼠AM膜核仁素蛋白表達(dá)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

注：A：對(duì)照組; B：LPS處理組; C：LPS+pBS-U6.C23shRNA組;D：LPS+pBS-U6.ControlshRNA組；﹡P<0.01與對(duì)照組比較；△P<0.01 與LPS組比較

三、AM中NF-κB活性變化

對(duì)照組大鼠AM中NF-κB活性較弱，經(jīng)LPS處理后，各組大鼠AM中NF-κB活性顯著增加，與A組相比，組間差異非常明顯(P<0.01)。C組大鼠AM中NF-κB活性明顯降低，與B組比較，差異顯著(P<0.05)；而D組與B組比較，組間無(wú)明顯差異(P>0.05)，見(jiàn)圖3。

四、BALF中TNF-α 和IL-6的含量

經(jīng)LPS誘導(dǎo)肺損傷后，顯著增加了大鼠BALF中促炎因子TNF-α 和IL-6的表達(dá)，各組和A組相比差異顯著(P<0.01)；C組大鼠BALF中TNF-α 和IL-6的含量顯著降低，與B組相比差異顯著(P<0.01)；而D組與B組相比，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖4。

注：A：對(duì)照組；B：LPS處理組；C：LPS+pBS-U6.C23shRNA組；D：LPS+pBS-U6.ControlshRNA組；﹡P<0.01 與對(duì)照組比較；△P<0.05 與LPS組比較

注：A：對(duì)照組；B：LPS處理組；C：LPS+pBS-U6.C23shRNA組；D：LPS+pBS-U6.ControlshRNA組；﹡P<0.01 與對(duì)照組比較；△P<0.01 與LPS組比較

討 論

AM是肺先天免疫系統(tǒng)中的前衛(wèi)細(xì)胞，是接觸抗原最早、機(jī)會(huì)最多的細(xì)胞，也是LPS的靶細(xì)胞。其表面多種膜受體和膜分子如CD14、Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)、β2整合素(CD11/CD18)以及甘露糖受體(mannose receptor,CD206)等均參與了LPS的識(shí)別及信號(hào)傳導(dǎo)，但阻斷這些受體并不能完全抑制炎癥因子的釋放和減輕肺損傷，提示還有其他膜受體存在的可能性；并且LPS還可能與某些膜受體結(jié)合并被轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)，直接激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)[10]。因此，進(jìn)一步明確LPS的膜結(jié)合受體及信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，有利于闡明LPS致ALI的發(fā)病機(jī)制及尋找新的治療靶點(diǎn)。

核仁素以磷酸化的形式存在于細(xì)胞膜表面，已知它在單核-巨噬細(xì)胞膜表面有表達(dá)并且具有與糖蛋白中的多糖鏈結(jié)合的特性[11-14]，依據(jù)這一特性同時(shí)由于LPS分子結(jié)構(gòu)中含有O-側(cè)鏈多糖，有學(xué)者提出單核巨噬細(xì)胞膜核仁素可能識(shí)別LPS而參與LPS所致炎癥反應(yīng)的假說(shuō)。方立等[5]發(fā)現(xiàn)核仁素存在于人外周血單核細(xì)胞(THP-1)膜表面，抗核仁素抗體可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的早期炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β的表達(dá)與分泌。在內(nèi)毒素血癥小鼠的肺組織和RAW264.7 細(xì)胞炎癥模型中，相對(duì)分子量為110×103的核仁素表達(dá)上調(diào)，相對(duì)分子量為80×103的核仁素片段表達(dá)減少，在核仁素過(guò)表達(dá)組LPS所致的IL -1β釋放明顯增加；而在核仁素低表達(dá)組LPS所致的IL -1β釋放明顯減少[6]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性菌感染人THP-1單核細(xì)胞時(shí)伴有核仁素表達(dá)上調(diào)；LPS誘導(dǎo)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞活化時(shí)伴有核仁素裂解片段的表達(dá)下調(diào)[7-8]。我們前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大鼠AM膜核仁素在LPS的識(shí)別和信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但其具體的結(jié)合機(jī)制和信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制尚未明確[9]。

由于AM膜核仁素分子處于LPS信號(hào)識(shí)別和轉(zhuǎn)導(dǎo)的上游環(huán)節(jié)，如果能減少膜核仁分子表達(dá)和或抑制膜核仁分子的生物學(xué)作用，則有可能從上游環(huán)節(jié)入手來(lái)阻斷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，避免產(chǎn)生過(guò)度的炎癥反應(yīng)，從而在LPS所致的ALI發(fā)病早期開(kāi)展有效的抗炎治療。我們采用RNA干擾技術(shù)，來(lái)沉默目的基因?；贏LI的器官特異性，我們選擇了氣管內(nèi)滴入的方法轉(zhuǎn)染pBS -U6C23shRNA質(zhì)粒。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了jetPEITM體內(nèi)轉(zhuǎn)染shRNA的高效性和安全性，與對(duì)照組相比，BALF中AM膜核仁素蛋白表達(dá)明顯下降，干擾效率達(dá)到72%同時(shí)也說(shuō)明通過(guò)氣道轉(zhuǎn)染的方法是安全可行的。實(shí)驗(yàn)中我們對(duì)比分析了各組大鼠BALF中的TNF-α和IL-6的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)預(yù)先給予氣管內(nèi)轉(zhuǎn)染pBS-U6C23shRNA質(zhì)粒后，BALF中的TNF-α和IL-6蛋白表達(dá)水平均明顯降低，NF-κB的活性也明顯下降，進(jìn)一步在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了RNA干擾對(duì)膜核仁素介導(dǎo)的LPS信號(hào)傳導(dǎo)具有明顯的阻斷作用。其次，我們還發(fā)現(xiàn)氣管內(nèi)滴入的方法轉(zhuǎn)染pBS-U6C23shRNA質(zhì)粒后，一定程度上可以改善、緩解肺的病理?yè)p傷，說(shuō)明核仁素RNA干擾在一定程度上減輕了肺損傷，減輕了肺部炎癥，提示AM膜核仁素在LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI的發(fā)病過(guò)程中起到一定作用。RNA干擾可以通過(guò)抑制AM膜核仁素表達(dá)，減少LPS內(nèi)化入AM，降低NF-κB活性，減少分泌TNF-α和IL-6炎癥因子，減輕肺損傷，因此，沉默核仁素基因有望成為防治LPS所致ALI的有效手段之一。

沉默核仁素基因可通過(guò)阻斷AM信號(hào)通路來(lái)減輕炎癥反應(yīng)，從而可能對(duì)LPS所致的ALI起到保護(hù)作用。但由于本研究以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物作為載體，具有一定的局限性，尚需進(jìn)一步的臨床實(shí)驗(yàn)為防治LPS所致的ALI提供更有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)

1 Tsushima K,King LS,Aggarwal NR,et al. Acute lung injury review[J]. Intern Med,2009,48(9): 621-630.

2 劉 濤，任成山. 炎癥介質(zhì)在急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征發(fā)病機(jī)制中的作用[J/CD]. 中華肺部疾病雜志：電子版，2013，6(3)：265-269.

3 陳向軍，馬李杰，侯紹杰，等. 白藜蘆醇對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷的保護(hù)作用[J/CD]. 中華肺部疾病雜志：電子版，2013，6(1)：20-24.

4 Bartova E,Horakova AH,Uhlirova R,et al. Structure and epigenetics of nucleoli in comparison with non-nucleolar compartments[J]. J Histochem Cytochem,2010,58(5): 391-403.

5 方 立,王慷慨,蔣 磊,等. 膜表面核仁素對(duì)脂多糖所致TNF-α和IL-1β表達(dá)的影響[J]. 中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2008,33(11): 999-1004.

6 張 彬,肖獻(xiàn)忠,張文輝,等. 核仁素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的白細(xì)胞介素1β釋放的影響[J]. 中國(guó)病理生理雜志,2010,26(9): 1796-1800.

7 Saba JA,McComb ME,Potts DL,et al. Proteomic mapping of stimulus-specific signaling pathways involved in THP-1 cells exposed to Porphyromonas gingivalis or its purified components[J]. J Proteome Res,2007,6(6): 2211-2221.

8 Zhang X,Kuramitsu Y,Fujimoto M,et al. Proteomic analysis of macrophages stimulated by lipopolysaccharide: Lipopolysaccharide inhibits the cleavage of nucleophosmin[J]. Electrophoresis,2006,27(8): 1659-1668.

9 Wang Yi,Mao Mei,Xua Jian-cheng. Cell-surface Nucleolin is involved in Lipopolysaccharide internalization and signaling in alveolar macrophages[J]. Cell biology international,2011,35(7): 677-685.

10 Wang Yanyan,Yang Yang,Liu Xin,et al. Inhibition of clathrin/dynamin-dependent internalization interferes with LPS-mediated TRAM-TRIF-dependent signaling pathway[J]. Cell Immunol,2012,274(1-2): 121-129.

11 Hirano K,Miki Y,Hirai Y,et al. A multifunctional shuttling protein nucleolin is a macrophage receptor for apoptotic cells[J]. J Biol Chem ,2005,280(47): 39284-39293.

12 Miki Y,Tazawa T,Hirano K,et al.Clearance of oxidized erythrocytes by macrophages: involvement of caspases in the generation of clearance signal at band 3 glycoprotein[J]. Biochem Biophys Res Commun ,2007,363(1): 57-62.

13 Krantz S,Salazar R,Brandt R,et al. Purification and partial amino acid sequencing of a fructosyllysine-specific binding protein from cell membranes of the monocyte-like cell line U937[J]. Biochim Biophys Acta,1995,1266(1): 109-112.

14 Semenkovich CF,Ostlund RE Jr,Olson MO,et al. A protein partially expressed on the surface of HepG2 cells that binds lipoproteins specifically is nucleolin[J]. Biochemistry,1990,29(41): 9708-9713.