內(nèi)毒素加肥甘飲食建立大鼠濕熱模型的效果研究*

★ 李華鋒 張競(jìng)之 區(qū)鴻斌

(廣州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院中醫(yī)科 廣東 廣州 510260)

濕熱證是臨床上常見的病證，包括外感濕熱病證和內(nèi)傷濕熱病證。對(duì)于濕熱證的動(dòng)物模型研究，目前應(yīng)用較多的造模方法主要有兩種，一是濕熱環(huán)境+高脂飲食+細(xì)菌感染，二是高脂飲食+內(nèi)毒素。前者多用于濕熱證急性造模，缺點(diǎn)是長(zhǎng)期的濕熱環(huán)境可能造成動(dòng)物的大量死亡，而且急性模型的應(yīng)用限制性也很大。對(duì)于第二種方法，目前的研究都是以兔為動(dòng)物模型，沒有用大鼠做為動(dòng)物模型，而大鼠在炎癥因子的信號(hào)傳導(dǎo)通路及因子的活化表達(dá)上與人更為接近，能否以大鼠為模型制造出更接近人體的濕熱證模型，國內(nèi)外尚無相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)即從這一思路入手，分別用肥甘飲食、內(nèi)毒素、肥甘飲食+內(nèi)毒素的方法建立大鼠的濕熱模型，以比較不同方法造模的效果差別，并探討大鼠濕熱模型成模的機(jī)制及改進(jìn)手段。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物 80只6～8周齡SPF級(jí)Wistar大鼠，雌雄各半，體重80～100g，購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物合格證號(hào)：粵檢證字SCXK(粵)-2004-0011。

1.1.2 材料和儀器 ELISA相關(guān)試劑盒購自武漢博士德公司，兔抗大鼠IL-2或NF-κB及羊抗兔二抗購自美國SantCruz公司，大腸桿菌內(nèi)毒素購自Promega公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 80只大鼠，隨機(jī)分為4組，每組20只，雌雄各半。第1組(正常組)予正常飲食，第2組予肥甘飲食(5%豬油、3%雞蛋黃、5%蜂蜜摻入普通飼料)造模，第3組以內(nèi)毒素(鼠尾靜脈注射大腸桿菌內(nèi)毒素2μg/kg，每周2次)造模，第4組以肥甘飲食+內(nèi)毒素造模。各組均造模6周后，取大鼠腹主動(dòng)脈血檢測(cè)IL-2、NF-κB的表達(dá)水平。

1.2.2 ELISA測(cè)定IL-2、NF-κB的表達(dá) 采用雙抗體夾心ABC-ELISA法。用抗IL-2或NF-κB單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品中的IL-2或NF-κB與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗IL-2或NF-κB抗體，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化物酶標(biāo)記的Steptavidin與生物素結(jié)合，加入酶底物OPD出現(xiàn)黃色，加終止液硫酸，顏色變深，在492nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值A(chǔ)，IL-2或NF-κB濃度與A值成正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中的IL-2或NF-κB濃度。

2 結(jié)果

2.1 各種大鼠體內(nèi)IL-2的表達(dá) 正常組、肥甘飲食組、內(nèi)毒素組大鼠IL-2的表達(dá)均為低表達(dá)，且3組之間無明顯差別，肥甘飲食+內(nèi)毒素組IL-2的表達(dá)較前3組明顯升高(P<0.05)，見表1、圖1。

2.2 各組大鼠體內(nèi)NF-κB的表達(dá) 正常組、肥甘飲食組、內(nèi)毒素組大鼠NF-κB的表達(dá)均為低表達(dá)，且3組之間無明顯差別，肥甘飲食+內(nèi)毒素組NF-κB的表達(dá)較前3組明顯升高(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 各組樣本IL-2、NF-κB的表達(dá)

注：1)與第1組比較，差異無顯著性，P>0.05；2)與第1組比較，差異有顯著性，P<0.05；3)與第2組比較，差異有顯著性，P<0.05；4)與第3組比較，差異有顯著性，P<0.05。

圖1 ELISA檢測(cè)各組樣本

3 討論

目前對(duì)濕熱證本質(zhì)的研究思路呈兩大趨勢(shì)：一是對(duì)臨床濕熱證患者相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，力圖從免疫功能、微量元素、自由基水平、血脂代謝、電解質(zhì)水平、致炎因子、脾胃功能等方面來揭示濕熱證的本質(zhì)；二是運(yùn)用傳統(tǒng)中醫(yī)理論造模，對(duì)模型從病理、生化、免疫、微量元素、胃腸動(dòng)力等多角度，多側(cè)面探討證的本質(zhì)。目前多強(qiáng)調(diào)“濕”性致病因子在濕熱中的作用，比如從電解質(zhì)水平、水通道蛋白、殺菌通透性蛋白、血脂代謝、胃腸激素等方面探討其本質(zhì)；對(duì)于“熱”性致病因子，目前僅認(rèn)為與內(nèi)毒素及其誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子和抗內(nèi)毒素、抗炎因子、體內(nèi)氧化物與抗氧化物的活性失衡有關(guān)。但濕熱纏綿難愈，相互交蒸，難分難解，探討濕與熱兩類致病因子的相互作用是研究濕熱證的突破口之一。

在本研究中，通過用內(nèi)毒素與肥甘飲食的方法建立大鼠濕熱模型，其中內(nèi)毒素所啟動(dòng)的炎癥因子可作為“熱”致病因子作用的靶點(diǎn)，而肥甘飲食導(dǎo)致的血脂紊亂則為“濕”性致病因子提供了作用平臺(tái)。本實(shí)驗(yàn)觀察到，單用肥甘飲食或者單用內(nèi)毒素的方法，是無法造成成功的濕熱證模型的，肥甘飲食組或內(nèi)毒素組的大鼠體內(nèi)炎癥水平與正常大鼠無明顯差別，說明單獨(dú)的“濕”或者單獨(dú)的“熱”都無法構(gòu)成標(biāo)準(zhǔn)的濕熱證模型，只有在“濕”的基礎(chǔ)上啟動(dòng)“熱”的因素，才能最終導(dǎo)致體內(nèi)炎癥因子的活化和濕熱模型的成功建立，顯然這一結(jié)果也符合中醫(yī)學(xué)的理論，《臨證指南醫(yī)案》即指出：“初病濕熱在經(jīng)，久則瘀熱入絡(luò)?！闭f明濕熱蘊(yùn)蒸日久可以導(dǎo)致血瘀。

本實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)，IL-2和NF-κB的活化可以作為濕熱證建立的重要指標(biāo)之一。NF-κB是一種具有多項(xiàng)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，通過調(diào)節(jié)免疫和炎癥相關(guān)因子及炎癥遞質(zhì)的表達(dá)，在炎癥和免疫反應(yīng)中起樞紐作用。而作為NF-κB的下游炎癥因子，IL-2在被啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄后，最終可與大批細(xì)胞因子(如TNF-a、IL-1、IL-6、IL-8等)、粘附分子、組織因子、血管緊張素原、誘生型一氧化氮合酶、誘生型環(huán)氧合酶、MCP-1等一起大量表達(dá)，通過促炎作用導(dǎo)致濕熱證和體內(nèi)非特異性炎癥的發(fā)生發(fā)展。這與已有的研究是一致的[1]。究其原因，可能是因?yàn)樵跐駸嶙C動(dòng)物模型中，生物致病因子能夠成功的模擬“熱”，亦即內(nèi)毒素及其誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子等可被認(rèn)為是“熱”性致病因子，體內(nèi)的炎癥水平必須要建立在血脂紊亂的基礎(chǔ)上才能導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)環(huán)境的紊亂和功能的失調(diào)，最終導(dǎo)致濕熱證的發(fā)生。

[1]Pahl HL. Activators and target genes of Rel/NF-kappB transcription factors[J]. Oncogene, 1999，18(49):6 853-6 866.