NBT自動分析法測定D—3羥丁酸

牛慶慧　江月萍　王光蘭等

[摘要] 目的 建立簡便和靈敏的雙試劑自動化分析法測定血清D-3羥丁酸。 方法 在NAD和D-3羥丁酸脫氫酶存在下，用氯化硝基四氮唑蘭（NBT）作為顯色劑測定血清中的D-3羥丁酸。 結果 該法線性范圍為0～7.0mmol/L，平均回收率為98.7%，批內變異系數(shù)和批間變異系數(shù)均小于2%，與對照試劑盒比較有良好的相關性（r2 =0.996），具有良好的抗干擾能力。150例健康人血清D-3羥丁酸含量為0.03～0.30mmol/L。 結論 NBT自動分析法測定D-3羥丁酸方法簡便、靈敏可靠、適合臨床應用。

[關鍵詞] D-3羥丁酸；血清；自動分析法；NBT

[中圖分類號] R446.1 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2014）13-115-03

[Abstract] Objective To establish a simple and sensitive automatic method for determination of D-3-hydroxybutyric acid in serum with two reagents. Methods With the existence of NAD and D-3-hydroxybutyrate dehydrogenase， D-3-hydroxybutyric acid in serum was determined by NBT as a color-developing agent. Results The linearity range of the method was 0-7.0 mmol/L， average recovery rate was 98.7%， and both the intra-assay and inter-assay coefficients of variation were less than 2%. There was a good correlation compared with the reference kit （r2=0.996）， and the capacity of resisting interference was good. The concentration of D-3-hydroxybutyric acid in the serum of 150 healthy people was 0.03-0.30 mmol/L. Conclusion The NBT automatic analysis method for determination of D-3-hydroxybutyric acid is simple， sensitive and reliable， which is appropriate to be applied clinically.

[Key words] D-3-hydroxybutyric acid； Serum； Automatic analysis method； NBT

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，酮癥及酮癥酸中毒是糖尿病患者最常見的并發(fā)癥[1-2]，糖尿病酮癥酸中毒是指糖尿病患者在各種原因的作用下，胰島素不足，生糖激素異常升高，而導致的高血糖、高血酮、水電解質酸堿失衡等。在肝臟中，脂肪酸氧化分解的中間產(chǎn)物乙酰乙酸、D-3羥丁酸及丙酮，三者統(tǒng)稱為酮體，其中D-3羥丁酸是酮體主要的成分，約占其總量的70%，因此臨床以檢測血清中D-3羥丁酸的濃度來反映體內酮體的水平[3-4]。D-3羥丁酸檢測方法有氣相色譜法[5]、分光度法和酶法，酶法在準確性、抗干擾能力和重復性等方面具有特殊的優(yōu)勢[6]，但價格都比較昂貴。而國內現(xiàn)有國產(chǎn)D-3羥丁酸試劑盒所用的顯色劑均為INT，還沒有使用NBT作為顯色劑的方法。我們首次報道以NBT作為顯色劑，雙試劑兩點終點法自動化測定血清D-3羥丁酸的新方法。該法準確、靈敏、穩(wěn)定，值得臨床推廣。

實驗原理：采用酶化學比色法來測定血清中的D-3羥丁酸，先將血清中的D-3羥丁酸氧化為乙酰乙酸，同時將輔酶Ⅰ還原為還原型輔酶Ⅰ，還原型輔酶Ⅰ在黃遞酶的催化下將NBT生成紅色顯色物質，在505nm處檢測吸光度的變化來計算血清中D-3羥丁酸的濃度。

D-3羥丁酸 +輔酶Ⅰ乙酰乙酸 +還原型輔Ⅰ

還原型輔酶Ⅰ+NBT formazane（紅色）

1 材料與方法

1.1 試劑

2 結果

2.1 靈敏度

將總濃度為1.0mmol/L的D-3羥丁酸用生理鹽水將做100倍稀釋，同時測定10次，分別計算出各濃度梯度的標準差和平均值；當D-3羥丁酸的濃度為0.01mmol/L時，平均值-3標準差>3標準差。表明靈敏度可達0.01mmol/L。

2.2 線性范圍

使用生理鹽水對1份D-3羥丁酸濃度為8mmol/L的高值血清樣本進行稀釋，分別是0.01、0.02、0.04、0.08、0.20、0.40、0.80、2.00、4.00、8.00mmol/L 10個不同濃度，各濃度均檢測5次， 進行相關分析，以每個濃度對應的吸光度值為y，對應的理論濃度為x。發(fā)現(xiàn)在0.01～8.00mmol/L濃度梯度內線性回歸方程為y=1.0023x + 0.0032，r2=0.996，表明該方法在此濃度范圍內呈線性。

2.3 精密度

分別對RANDOX公司的低值和高值質控以及1份患者隨機血清共3個樣本每天測定3次，檢測平均值和變異系數(shù)（CV值），連續(xù)測定20d。見表1。

2.4 方法對比試驗

分別用德國Diasys公司D-3羥丁酸試劑盒（x）和本試驗方法（y）對80份濃度范圍在0.01～8.00mmol/L的D-3羥丁酸臨床血清標本進行檢測，試驗結果進行相關性分析，考察兩種方法的相關性，最終得到的結果為：y=0.975x+0.34，r2=0.995，實驗結果表明，本方法的實驗結果與德國Diasys公司的D-3羥丁酸試劑盒具有良好的相關性。

2.5 回收試驗

用RANDOX的D-3羥丁酸濃度為0.5mmol/L標準血清進行回收試驗，來評價此方法的準確性，分別加入0.124mmol/L、0.642 mmol/L、2.471mmol/L的標準液，用來組成基礎樣本、回收樣本1和回收樣本2，回收率（%）=（回收樣本檢測值-基礎樣本檢測值）/加入的標準液濃度，最終計算回收率為96.2%～102.4%，平均回收率為98.7%，說明該方法具有不錯的檢測準確性。

2.6 干擾試驗

取1份混合血清，分別配成不同濃度的膽紅素、甘油三酯和血紅蛋白血清樣本，使用生理鹽水作對照，各個樣本均檢測10次，最終分析發(fā)現(xiàn)：三種常見的干擾物分別在100mg/dL、200mg/dL和200mg/dL時，對本試劑幾乎無干擾。

2.7 穩(wěn)定試驗

加入防腐劑和穩(wěn)定劑后，放于37℃中保存10d穩(wěn)定性正常，測定結果沒有明顯變化，在4℃中能夠開口保存30d穩(wěn)定性正常。

2.8 正常參考范圍

選擇150名體檢合格成年人，男80名，女70名，年齡20～65歲?？崭轨o脈取血，用本法測的P2.5=0.03，P97.5=0.3因此得出正常人隨機血清D-3羥丁酸含量參考范圍是0.03～0.30mmol/L。

3 討論

近年來，我國糖尿病患病率逐漸增加，當發(fā)生此病機體細胞內葡萄糖的氧化利用障礙，此時機體動用體內脂肪，通過脂肪分解供能，肝臟脂肪酸代謝旺盛，產(chǎn)生大量酮體，從而導致酮癥酸中毒的發(fā)生，所以及時準確的診斷此癥的發(fā)生，對后續(xù)治療有較大的臨床意義。測定血液中D-3羥丁酸的濃度對糖尿病酮癥酸中毒的診斷有著重要意義。在酮癥酸中毒早期，尿酮水平無法測定時，血液中D-3羥丁酸即可測定。當患者出現(xiàn)酮癥酸中毒的時候，血液中D-3羥丁酸濃度升高，此時檢測血液中D-3羥丁酸濃度可以有效的檢測患者的病情以及預測預后。目前國產(chǎn)試劑中均使用了INT作為顯色劑，這種試劑具有穩(wěn)定性差，使用不方便等方面的問題，故建立了一種新型的檢測D-3羥丁酸的方法非常有必要[10-12]。

試劑中我們對黃遞酶和D-3羥丁酸的濃度進行了梯度分析，最終選擇現(xiàn)在的濃度，這樣既保證了反應的線性和準確性，又可以通過添加保護劑保證了酶的穩(wěn)定性，而且可以去除膽紅素、甘油三酯的干擾。通過回收試驗和對比試驗，試劑的準確性較高。通過精密度試驗，試劑的重復性較好。同時該方法的靈敏度為0.01mmol/L，該靈敏度完全能夠保證臨床檢測的需要。0.01～8.00mmol/L的檢測線性范圍，與國外的試劑相比，具有更寬的線性范圍，能夠保證高值樣本準確的檢測。從穩(wěn)定性試驗來看，該方法在該試劑在37℃和開口4℃中均能夠保證很好的穩(wěn)定性，解決了保存的問題，表明在方法的試劑在市場應用中具有很好的前景。我們研究使用NBT作為顯色劑的D-3羥丁酸試劑盒相比現(xiàn)有的試劑盒擁有更好的線性范圍和穩(wěn)定性，而準確性與國外的試劑盒比較也有很好的相關。實驗結果表明選用NBT作為顯色劑的該檢測方法具有很好的前景，是一種適用于臨床的值得推廣的方法。

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（收稿日期：2014-04-24）