羥亞胺GC/FID定量分析方法的條件優(yōu)化

苗翠英, 徐浩龍

(中國人民公安大學刑事科學技術學院，北京 100038)

0 引言

羥亞胺(Hydroxyl imine)，分子式: C13H16ClNO,化學名稱：1-羥基環(huán)戊基-2-氯苯基-N-甲基亞胺基酮，分子量: 237。常見存在形式為鹽酸羥亞胺, 高純度鹽酸羥亞胺為乳白色或白色粉末, 熔點175～185 ℃。工業(yè)用非高純度鹽酸羥亞胺為咖啡色粉末。羥亞胺和氯胺酮是同分異構體，羥亞胺經過化學反應可得到氯胺酮[1]。作為生產氯胺酮的主要原料，羥亞胺已成為我國新的制毒原料。2008 年4月23 日, 國務院已批準將鹽酸羥亞胺列入第一類易制毒化學品。2008年7月8日，公安部、商務部、衛(wèi)生部、海關總署等6部委聯(lián)合下發(fā)公告，對羥亞胺的生產、經營、購買、運輸及進、出口管理進行了規(guī)定，以加強對鹽酸羥亞胺的嚴格管制[2-3]，進一步有效遏制我國氯胺酮的非法生產及濫用。

羥亞胺和氯胺酮為同分異構體，實際辦案中兩種物質經常同時檢出[4-5]。國內外關于羥亞胺檢測方法研究、報道較少。目前國內檢驗羥亞胺的主要方法為氣相色譜/質譜分析方法，該方法可以對羥亞胺進行定性分析[6-7]，但不能準確地定量分析。羥亞胺是我國2008年列入管制的易制毒化學品，國際毒品案件中較少出現(xiàn)，目前標準質譜庫中沒有其質譜圖，因此，氣相色譜/質譜分析方法檢驗羥亞胺需人工解析質譜圖或通過核磁共振法進行確證[8-9]，雖然方法較為準確，但對檢驗人員專業(yè)水平及儀器設備要求較高。為了在實際辦案中達到方便快捷的定量效果，關于羥亞胺的定量研究方向有待進一步拓展。

1 實驗部分

1.1 主要儀器和試劑

SHIMADZU GC2010 GC/FID(日本島津公司)；

0.01 mg 級天平(瑞典 梅特勒公司)；

震蕩器(日本 EYELA公司)；

移液槍：100 μL～1 000 μL (德國 Eppendorf公司)；

瓶口移液器：標稱容量10 mL (德國 Brand公司)；

進樣針：50 μL、100 μL、250 μL (瑞士 Hamilton公司)。

1.2 檢測樣品

稱取鹽酸羥亞胺對照品5.77 mg加入甲醇溶液溶解并準確定容至5 mL，制成含鹽酸羥亞胺1.154 mg/mL的甲醇溶液。用移液管精密移取上述對照品溶液1 mL，加入甲醇溶液定容至10 mL，制成鹽酸羥亞胺濃度為0.115 4 mg/mL(羥亞胺堿濃度為0.1 mg/mL )的樣本溶液。

1.3 實驗條件

毒品大部分極性較弱，弱極性色譜柱對于弱極性物質具有廣譜適用范圍，適用于毒品檢測。因此色譜柱選擇：DB- 5石英玻璃毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，弱極性色譜柱；

羥亞胺熱穩(wěn)定性好，因此選擇：高溫檢測溫度，300 ℃；進樣溫度 ，280 ℃；柱終溫，280 ℃；

載氣 ：N2，純度>99.99% ；尾吹:30 mL/min；進樣量：1 μL；燃燒氣：H2；燃燒氣流速：40 mL/min。

1.4 實驗內容

GC/FID的定量效果取決于其分離效果，分離效果的直觀表現(xiàn)是理論塔板數(shù)。理論塔板數(shù)受升溫速率、初始柱溫、柱流速、分流比的影響。因此本文從升溫速率、初始柱溫度、柱流速、分流比等4項參數(shù)進行優(yōu)化，以羥亞胺響應峰的理論塔板數(shù)、保留時間、峰面積、抗干擾情況以及工作曲線為參考標準，對分析方法的參數(shù)進行考察。實驗中，各組實驗參數(shù)設定一個為變量，其他恒定。

1.4.1 升溫速率實驗

在載氣流速1 mL/min、分流比20∶1、初始柱溫100 ℃的實驗條件下，對升溫速率進行考察。實驗升溫速率設定值從5 ℃/min升至20 ℃/min。

1.4.2 初始柱溫實驗

在載氣流速1 mL/min、分流比20∶1、升溫速率16 ℃/min的實驗條件下，對初始柱溫進行考察。實驗初始柱溫從50 ℃升至200 ℃。

1.4.3 載氣流速實驗

在分流比20∶1、初始柱溫100 ℃、升溫速率16 ℃/min的實驗條件下對載氣流速進行考察。實驗載氣流速從0.5 mL/min升至2 mL/min。

1.4.4 分流實驗

在流速1 mL/min、初始柱溫100 ℃、升溫速率16 ℃/min的實驗條件下對分流比進行考察。實驗分流比從5∶1升至50∶1。

1.4.5 抗干擾實驗

在流速 1 mL/min、初始柱溫100 ℃、升溫速率16 ℃/min、分流比20∶1的實驗條件下，將羥亞胺樣品加入案件中繳獲的搖頭丸檢材，對本實驗樣本進行分析，并考察羥亞胺和搖頭丸中甲基苯丙胺、咖啡因和氯胺酮的分離度。

1.4.6 外標法定量工作曲線實驗

稱取羥亞胺標準物質樣本50 mg，放入50 mL容量瓶中加入甲醇，配制成1 mg/mL的羥亞胺標準溶液，并依次用甲醇稀釋至0.1 mg/mL、0.05 mg/mL、0.001 mg/mL、0.005 mg/mL、0.000 1 mg/mL濃度的羥亞胺溶液分別進樣，每個濃度的樣品平行進樣3次，在流速為 1 mL/min、初始柱溫100 ℃、升溫速率16 ℃/min、分流比 20∶1的色譜條件下進行分析和檢測，用峰面積積分值(Y)對濃度(X)進行線性回歸，采用0.1 mg/mL、0.05 mg/mL、0.01 mg/mL、0.005 mg/mL、0.001 mg/mL、0.000 5 mg/mL、0.000 1 mg/mL 7個濃度繪制成線性范圍為0.000 1 mg/mL～0.1 mg/mL的羥亞胺標準工作曲線。

1.4.7 精密度實驗

在流速 1 mL/min、初始柱溫100 ℃、升溫速率16 ℃/min、分流比 20∶1實驗條件下，連續(xù)7天每日連續(xù)檢測10次羥亞胺樣本，考察日間精密度和日內精密度，計算出各自的SD和RSD值，考察本方法的精密度參數(shù)。

2 結果與討論

2.1 升溫速率

升溫速率與理論塔板數(shù)線性關系如圖1和圖2。實驗結果表明，升溫速率相對于理論塔板數(shù)的變化率明顯低于初始溫度相對于理論塔板數(shù)的變化率，說明升溫速率對柱效變化的影響小于初始溫度。為維持較高柱效，初始溫度不宜變化太大，因此本方法宜優(yōu)先對升溫速率進行實驗。

圖1 升溫速率- 理論塔板數(shù)變化曲線圖

圖2 初始溫度- 理論塔板數(shù)變化曲線圖

圖1曲線可見，當升溫速率在5 ℃/min到20 ℃/min之間變化時，理論塔板數(shù)在降低；在16 ℃/min時，理論塔板數(shù)下降的斜率增大。為了達到一定的柱效，應從升溫速率對柱效變化影響相對較小的穩(wěn)定區(qū)間內選擇合適的升溫速率，見圖3。當升溫速率小于或等于16 ℃/min 時，理論塔板數(shù)比保留時間的曲線呈上升趨勢；當升溫速率大于16 ℃/min 時，理論塔板數(shù)比保留時間曲線呈下降趨勢。

圖3 升溫速率- 理論塔板數(shù)變化曲線圖

綜上所述，為減少分析時間、提高柱效和保護儀器，以 16 ℃/min為較優(yōu)升溫速率。

2.2 初始柱溫

初始柱溫與理論塔板數(shù)的關系如圖4所示。由圖 4曲線2可見，初始柱溫升高的同時理論塔板數(shù)呈線性下降。因進樣口溫度和初始柱溫溫差越大，羥亞胺越容易冷凝在色譜柱頭，羥亞胺初始色譜帶沿柱軸方向展開越小同時分離能力越強。但在實際辦案中適用于批量檢材處理要求分析時間要適中，本實驗擬將時間控制在15 min內。如圖4曲線2所示，隨著初始溫度的增加理論塔板數(shù)變化曲線趨勢為直線下降，在100 ℃時理論塔板數(shù)和保留時間達到最優(yōu)值。

圖4 初始柱溫- 理論塔板數(shù)

綜上所述，綜合考慮儀器的柱效與待檢測組分的保留時間，選擇100 ℃作為羥亞胺GC分析方法的初始柱溫較為合適。

2.3 載氣流速

由圖5可見，當柱載氣流速在0.5 mL/min～0.8 mL/min 時，理論塔板數(shù)較高且理論塔板數(shù)隨柱流速的升高而顯著升高；當流速大于或等于1.1 mL/min 時，理論塔板數(shù)開始有較為明顯的降低。在0.9 mL/min～1.0 mL/min的范圍內理論塔板數(shù)較為平穩(wěn)。

圖5 柱流速- 理論塔板數(shù)變化曲線圖

綜上所述，從提高柱效和縮短分析時間兩方面綜合考慮，選擇1 mL/min的柱載氣流速較優(yōu)。

2.4 分流比

分流比將會影響氣相色譜的分析結果。在本實驗設定的條件下探究分流比與羥亞胺的氣相分析檢驗數(shù)據(jù)的關系，主要考察羥亞胺的色譜峰面積和理論塔板數(shù)。

圖6 分流比- 理論塔板數(shù)變化曲線圖

分流比對理論塔板數(shù)的影響如圖6所示，由圖可見分流比對理論塔板數(shù)的影響較小。分流比對羥亞胺峰面積的影響如圖7所示，其相關曲線拐點為分流比為20∶1，當分流比大于或等于15∶1時，曲線線性程度較高且線性陡峭；當分流比大于或等于20∶1 時，曲線呈一定線性，但線性趨緩且較為平穩(wěn)。在實際辦案中穩(wěn)定和重現(xiàn)性是重要因素之一，要選擇分流比- 峰面積變化曲線較平緩時的分流比，因為在這種參數(shù)下分流比有微小的波動不會對峰面積造成較大的影響，較為穩(wěn)定。同時，如果分流比過大，即實際的進樣量會較小，在進樣量較小的情況下，檢測靈敏度就會降低。

圖7 分流比- 峰面積(羥亞胺)變化曲線圖

綜上所述，20∶1的分流比應用于日常分析檢驗較為適合。

2.5 抗干擾結果分析

抗干擾分析結果如圖8所示，在流速1 mL/min、初始柱溫100 ℃、升溫速率16 ℃/min、分流比20∶1的實驗條件下，羥亞胺和樣本搖頭丸中甲基苯丙胺、咖啡因和氯胺酮具有較好分離度。羥亞胺和各組分的分離度如下：甲基苯丙胺95.248、咖啡因3.572、氯胺酮14.17。其中咖啡因和羥亞胺的分離度最小，其分離度值為3. 3.572>2，符合實際辦案檢驗要求。

圖8 羥亞胺和甲基苯丙胺、咖啡因、氯胺酮色譜峰圖

在實際辦案中常見的是對同一檢材中氯胺酮和羥亞胺的分別定性定量，在本實驗優(yōu)化的羥亞胺GC/FID儀器分析參數(shù)下，氯胺酮和各組分的分離度良好，完全滿足實際辦案中對于羥亞胺的檢驗要求。

2.6 工作曲線

在本實驗所選擇的優(yōu)化實驗參數(shù)下，GC/FID工作曲線各項參數(shù)良好，R值已經達到0.001數(shù)量級的要求。 0.000 1 mg/mL～0.1 mg/mL的羥亞胺標準工作曲線如圖9所示。

圖9 羥亞胺標準工作曲線

0.000 1 mg/mL～0.1 mg/mL標準工作曲線相關技術參數(shù)：Y=81 872.7X+23.384 4；R2=0.999 835 1；R=0.999 917 6。

在濃度為0.000 5 mg/mL和0.000 1 mg/mL時羥亞胺的相應理論峰面積應為40和8，但在此時羥亞胺的濃度過小，對儀器要求較高，在此情況下峰面積的計分結果誤差較大，本實驗的數(shù)據(jù)明顯偏離理論值。因此在本工作曲線所考察的7個濃度點中0.000 5 mg/mL和0.000 1 mg/mL的數(shù)據(jù)需要排除不計。排除羥亞胺濃度0.000 5 mg/mL和0.000 1 mg/mL后的實驗結果表明，本實驗所確定的羥亞胺檢驗鑒定GC/FID儀器的優(yōu)化實驗參數(shù)在檢測濃度0.001 mg/mL～0.1 mg/mL范圍內線性良好，線性回歸方程為：

Y=81 999.22X+13.677 89；R2=0.999 836 4；R=0.999 918 2。

在線性回歸方程中，本實驗所確定的優(yōu)化實驗參數(shù)下工作曲線各項參數(shù)良好，R值已經達到0.001數(shù)量級的要求，符合對毒品或易制毒化學品犯罪案件中檢驗羥亞胺的定量的要求，定量范圍為0.001 mg/mL～0.1 mg/mL。本方法檢測限可以達到0.001 mg/mL。

2.7 精密度實驗

在優(yōu)化實驗條件下測得的本實驗定量精密度數(shù)據(jù)：

日內精密度為:RSD=3.56(n=10)。日間精密度為:RSD=6.69(n=7)。

3 結論與展望

本文通過對羥亞胺GC/FID實驗條件中升溫速率、初始柱溫、載氣流速和分流比4項參數(shù)進行考察，得到優(yōu)化 GC/MS分析條件如下：色譜柱：DB- 5石英玻璃毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；載氣： N2，純度>99.99%；進樣溫度：280 ℃；流速：1 mL/min；分流比：20∶1；升溫程序：以 100 ℃為初始柱溫，以 16 ℃/min 升溫至 280 ℃；檢測溫度:300 ℃；尾吹:30 mL/min；燃燒氣：H2，40 mL/min；助燃氣：空氣，助燃氣流速：400 mL/min。

在此分析方法下，羥亞胺濃度為0.001 mg/mL～0.1 mg/mL濃度范圍內準確定性，羥亞胺保留時間9.68 min。

該方法能夠適用于日常辦案需求，定性定量準確、分析速度快。

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