哮喘患兒外周血RORC mRNA、IL-17水平及其與氣道重塑的關(guān)系研究

黃雪瓊 檀衛(wèi)平 王東燁 麥賢弟 吳葆菁 李靜 藍(lán)丹

支氣管哮喘是常見的氣道慢性疾病，除持續(xù)性氣道炎癥外，氣道重塑是哮喘的另一重要特征。氣道重塑病理基礎(chǔ)包括氣道上皮細(xì)胞和平滑肌增生、黏液高度分泌、上皮下組織纖維化，以及血管生成[1]。目前評估氣道炎癥的指標(biāo)包括，痰液中嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)，呼出氣一氧化氮等，而氣道重塑的評估需要行有創(chuàng)性氣道黏膜活組織檢查(活檢)，臨床難以實現(xiàn)。鑒于近年研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞及其介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞炎癥在哮喘氣道重塑過程中起著重要作用[2]。本研究擬通過檢測哮喘兒童外周血單個核細(xì)胞(PBMC)中Th17細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤兒核受體C(RORC) mRNA和主要效應(yīng)因子IL-17表達(dá)水平，以及通過高分辨CT(HRCT)觀察患兒氣道重塑的影像學(xué)改變，探討其相互聯(lián)系，為哮喘氣道重塑評估尋求新指標(biāo)，現(xiàn)報告如下。

對象與方法

一、研究對象

2010年9月至2012年8月在中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院兒科哮喘專科門診及住院就診的中重度持續(xù)哮喘兒童45例。其中處于哮喘急性發(fā)作期25例，男16例，女9例，年齡(7.9±2.3)歲；臨床緩解期(經(jīng)過治療或未經(jīng)治療癥狀、體征消失，肺功能恢復(fù)到急性發(fā)作前水平，并維持3個月以上)20例，男12例，女8例，年齡(8.2±2.5)歲。兒童哮喘診斷、分期、分度標(biāo)準(zhǔn)均按2008年中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼吸學(xué)組修訂的《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》中兒童支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。健康對照組：選擇20名進(jìn)行健康體檢的兒童，均為無過敏性疾病和近期無呼吸道感染的健康兒童，男10名，女10名，年齡(8.0±1.6)歲。CT對照組：選擇中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院小兒外科收治的10例肝母細(xì)胞瘤、原發(fā)性腹膜良性腫瘤患兒，年齡(7.2±2.5)歲，均無呼吸道病變。所有受試者無惡性腫瘤病史及自身免疫病史，近4 周內(nèi)未使用全身腎上腺皮質(zhì)激素(激素)等免疫抑制藥。

二、主要試劑及儀器

主要試劑包括：人IL-17 ELISA試劑盒，購自武漢中美公司；ABI MultiScribeTMReverse Transcriptase逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green 熒光染料試劑均購自美國ABI公司。HRCT使用SIEMENS SOMATOM Sensation 64 CT系統(tǒng)。

三、方 法

1.PBMC的分離和培養(yǎng)

抽取入選研究對象的外周靜脈血2 ml，使用依地酸二鈉抗凝。常規(guī)Ficoll密度梯度離心法分離PBMC， 加入RPMI 1640培養(yǎng)液重懸PBMC，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106/ml。每孔0.5 ml接種于24孔板，加入anti-CD3(OKT3)(0.2 mg/L)、 antiCD28(1 mg /L)，置于37℃、5 %CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，收集PBMC，置于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.PBMC的IL-17水平檢測

收集上述培養(yǎng)PBMC，采用雙抗體夾心ELISA法測定細(xì)胞IL-17的水平。具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)2個復(fù)孔，酶標(biāo)儀492 nm處測定各孔吸光值。

3.PBMC的RNA提取及實時定量PCR檢測

收集上述培養(yǎng)PBMC，采用Trizol試劑盒分離出總RNA，核酸測定儀測RNA純度(A260/A280)，純度要求為1.8～2.0。按照ABI MultiScribeTMReverse Transcriptase試劑盒說明書進(jìn)行半量體系RNA逆轉(zhuǎn)錄模板DNA。采用SYBE GREEN實時熒光定量PCR檢測RORC mRNA的表達(dá)水平，內(nèi)參基因NAPDH，半定量反應(yīng)體系(12.5 μl)，參照說明書設(shè)定PCR程序，95℃ 10 min變性，然后95℃ 15 s，60℃ 30 s，重復(fù)40個循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束，設(shè)定最佳閾值，獲取CT值，根據(jù)儀器給出的標(biāo)準(zhǔn)曲線和斜率，獲得目的基因的相對表達(dá)指數(shù)。引物由上海生物工程有限公司根據(jù)設(shè)計合成，序列見表1。

4.小支氣管氣道面積和管壁厚度變化的測量

選取其中14例病程較長[病程3～8(中位數(shù)4.5)年]的臨床緩解期患兒，采用HRCT進(jìn)行胸部檢測及支氣管壁測量。HRCT條件：層厚3 mm，取吸氣末3個橫斷層面(主動脈弓上、氣管分叉、下肺靜脈)進(jìn)行測量；橫斷圖像上每個層面選取雙側(cè)管腔內(nèi)徑0.5～2 mm的氣道各3支，取平均值作為每次的測量值。測量指標(biāo)：氣道內(nèi)徑(L)、氣道外徑(D)、氣道腔面積(Ai)、氣道總面積(Ao)。選用氣道壁厚度與氣道管腔外徑之比值(T/D)、氣道壁面積占?xì)獾揽偨孛娣e的百分比(WA%)及氣道腔面積(Ai)作為觀察指標(biāo)，見圖1。

表1 引物序列

圖1 小支氣管氣道面積和管壁厚度測量示意圖

四、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、中重度哮喘患兒與正常對照組PBMC中RORC mRNA、IL-17表達(dá)水平比較

哮喘急性發(fā)作期患兒RORC mRNA、IL-17表達(dá)水平明顯高于緩解期和正常對照組患兒(P<0.05)，與正常對照組相比，緩解期患兒IL-17水平明顯增高(P<0.05)，而兩組RORC mRNA表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

二、中重度哮喘緩解期患兒與正常對照組兒童支氣管測量T/D、WA%、Ai比較

與正常對照組兒童相比，哮喘緩解組患兒T/D、WA%均明顯增加，而Ai較正常對照組兒童狹窄(P均<0.05)，見表3。

三、中重度哮喘緩解期患兒T/D、WA%與IL-17相關(guān)性分析

中重度哮喘緩解期患兒T/D、WA%均與其PBMC IL-17水平呈正相關(guān)，r分別為0.78、0.77(P均<0.05)，見圖2。

表2 哮喘急性發(fā)作期、緩解期患兒和正常對照組兒童RORC mRNA、IL-17表達(dá)水平比較

表3 哮喘兒童T/D、WA%及Ai與正常兒童的比較

討 論

哮喘是一種免疫紊亂的變態(tài)反應(yīng)性疾病，主要表現(xiàn)為慢性氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑[4]。近年來Th17細(xì)胞作為 CD4+T細(xì)胞調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞參與哮喘氣道炎癥、氣道重建的中介作用備受關(guān)注[5]。我們的前期研究顯示IL-17與中重度兒童哮喘氣道中性粒細(xì)胞炎癥密切相關(guān)[6]。動物實驗顯示IL-17通過誘導(dǎo)IL-6、IL-8、PGE2及G-CSF等炎癥因子的產(chǎn)生，活化、動員中性粒細(xì)胞并募集到氣道，放大炎癥反應(yīng)；中性粒細(xì)胞活化后可釋放彈性蛋白酶、髓過氧化物酶及蛋白水解酶等介質(zhì)，參與氣道損傷和修復(fù)過程[7]。此外，IL-17還可刺激轉(zhuǎn)化生長因子-β、IL-11等多種促炎因子及黏蛋白基因表達(dá)，參與氣道上皮損傷、黏液高度分泌、氣道上皮下纖維化和血管生成等氣道重塑過程[8]。但兒童哮喘氣道重塑與IL-17之間的關(guān)系尚不清楚。

RORC和IL-17分別為Th17細(xì)胞的上游調(diào)控基因和主要效應(yīng)因子。RORC基因參與哮喘發(fā)病過程是由其下游的細(xì)胞Th17細(xì)胞與IL-17介導(dǎo)的。研究顯示，哮喘患者的肺組織RORC mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，同時外周血、支氣管灌洗液及痰液中IL-17表達(dá)均顯著增高，且與氣道高反應(yīng)性程度呈正相關(guān)[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患兒急性發(fā)作期外周血PBMC中RORC mRNA表達(dá)和IL-17水平明顯高于緩解期和正常對照組，緩解期患兒RORC mRNA表達(dá)降至正常，而IL-17水平仍明顯高于正常對照組，表明在哮喘的急性發(fā)作中轉(zhuǎn)錄因子RORC通過促進(jìn)細(xì)胞因子IL-17的基因轉(zhuǎn)錄，加重氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性[11]。IL-17水平在緩解期仍持續(xù)升高，則可能是通過減少翻譯后的蛋白降解途徑，參與哮喘的慢性過程。本研究通過HRCT檢查評估兒童哮喘的氣道重塑，發(fā)現(xiàn)與正常對照組比較，中重度哮喘患兒緩解期氣道管徑明顯狹窄，而氣道壁厚度和面積較正常對照組明顯增加，且與同期外周血IL-17表達(dá)水平呈正相關(guān)，表明IL-17不僅在哮喘急性發(fā)作期參與氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性，且在緩解期促進(jìn)氣道重塑的發(fā)生發(fā)展。

圖2 中重度哮喘緩解期患兒PBMC IL-17水平與同期氣道壁厚度(A)及面積(B)呈正相關(guān)

近年來兒童哮喘的治療目標(biāo)不僅要有效控制氣道慢性炎癥，更力求減少氣道重塑的發(fā)生，進(jìn)而減少兒童哮喘向成人哮喘發(fā)展。目前指南推薦的吸入性激素(ICS)治療雖能有效控制嗜酸性粒細(xì)胞介導(dǎo)的氣道炎癥，但對中性粒細(xì)胞炎癥及氣道重塑無效。IL-17作為促進(jìn)哮喘中性粒細(xì)胞炎癥的重要因子，與哮喘氣道重塑關(guān)系密切，有望成為防治哮喘的新靶點。

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