人源化抗Aβ抗體治療APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠的實(shí)驗(yàn)研究

馬晉 段金海 鄒俊濤 汪洋

阿爾茨海默病(AD)是一種以進(jìn)行性記憶力減退和認(rèn)知障礙為主要臨床特征的中樞神經(jīng)退行性疾病。研究表明，β淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)沉積形成老年斑是AD病理機(jī)制的中心環(huán)節(jié)。人源化抗Aβ抗體來源于健康人血，制備相對(duì)簡單，成本低。本研究采用純化的人源化抗Aβ抗體治療APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠，觀察抗體對(duì)AD轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)老年斑的清除作用、腦內(nèi)相關(guān)的細(xì)胞因子的變化以及動(dòng)物的認(rèn)知行為學(xué)變化，研究人源化抗Aβ抗體治療APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫治療效果及免疫類型，進(jìn)一步闡明抗Aβ抗體的免疫學(xué)機(jī)制，旨在為抗體進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)奠定理論基礎(chǔ)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

36只SPF級(jí)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠，6月齡，雌雄不拘，體質(zhì)量(45±5)g。品系名稱：B6C3-TG(APPSWE,PSEN1DE9)85DBO/J，簡稱APPSWe，相關(guān)基因APP、PS1，購于廣東省動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。

二、主要試劑和儀器

人源化抗Aβ抗體由廣東省人民醫(yī)院與本實(shí)驗(yàn)室共同制備并保管。HRP-羊抗小鼠IgG購自博士德公司。鼠源性抗Aβ單克隆抗體購自美國Sigma公司。MICROM HM340切片機(jī)、MICROM EC350包埋機(jī)均為德國Leica公司產(chǎn)品，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)儀、Morris水迷宮測(cè)試軟件為中國科學(xué)院產(chǎn)品， Bio-fuge15R低溫高速離心機(jī)為德國Heraeus Instruments公司產(chǎn)品。

三、 治療方法

將36只APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠分為人源化抗Aβ抗體組、鼠源性單克隆抗體10D5組(陽性對(duì)照組)和磷酸鹽緩沖液(PBS)對(duì)照組(陰性對(duì)照組)，每組各12只小鼠。人源化抗Aβ抗體組小鼠予腹腔注射人源化抗Aβ抗體40 μg，鼠源性單克隆抗體組予腹腔注射等劑量鼠源性單克隆抗體10D5，PBS對(duì)照組則予腹腔注射PBS，3組均為每周注射1次，每次注射體積均為100 μl，共治療3個(gè)月。

四、研究內(nèi)容

注射前及每次注射后，行Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，實(shí)驗(yàn)包含定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)，分別記錄平均潛伏期及跨越平臺(tái)次數(shù)，平均潛伏期越短說明小鼠的學(xué)習(xí)能力越好，跨越平臺(tái)次數(shù)越多說明小鼠的記憶力越好。

治療3個(gè)月后取小鼠尾靜脈血，處死小鼠。選取小鼠含海馬及其上方頂葉聯(lián)合皮質(zhì)范圍進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，觀察老年斑數(shù)量和分布情況。同時(shí)取小鼠腦組織勻漿，取上清液。分別檢測(cè)小鼠腦組織上清液和血清中TNF-α表達(dá)含量。

五、 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試結(jié)果

1.定位航行實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)第7周起，人源化抗Aβ抗體組及鼠源性單克隆抗體組平均逃避潛伏期均比PBS對(duì)照組縮短，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見圖1。

圖1 Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試中3組APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠平均逃避潛伏期比較

2.空間探索實(shí)驗(yàn)

與對(duì)照組相比，人源化抗Aβ抗體組與鼠源性單克隆抗體組跨越平臺(tái)次數(shù)明顯增多，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見圖2。

圖2 Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試中3組APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠跨越平臺(tái)次數(shù)比較

二、腦內(nèi)Aβ沉積免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

與PBS對(duì)照組比較，鼠源性單克隆抗體組與人源化抗Aβ抗體組大腦皮質(zhì)、海馬區(qū)棕色斑塊沉積明顯形態(tài)變小、數(shù)量變少、范圍分散，見圖3。

圖3 3組APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ沉積免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

三、血清和腦組織TNF-α檢測(cè)結(jié)果

人源化抗Aβ抗體組與鼠源性單克隆抗體組腦內(nèi)TNF-α含量均較PBS對(duì)照組明顯減少(P<0.05)，見表1。

討 論

隨著我國逐漸進(jìn)入老齡化社會(huì)，老齡相關(guān)性疾病增多，而腦老化導(dǎo)致的認(rèn)知功能下降及癡呆是影響老年人生活質(zhì)量的重要因素[1]。傳統(tǒng)藥物治療AD具有不良反應(yīng)大，難以個(gè)體化治療的缺點(diǎn)。被動(dòng)免疫治療AD 不需要激發(fā)T細(xì)胞以產(chǎn)生足夠量的抗體，避免了T細(xì)胞過度激活導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。 即使發(fā)生不良反應(yīng)，被動(dòng)免疫治療可及時(shí)終止，避免了機(jī)體對(duì)抗體的持續(xù)暴露。與傳統(tǒng)治療相比，被動(dòng)免疫治療便于根據(jù)不同的患者調(diào)整抗體的劑量，治療易于個(gè)體化。2000年Bard報(bào)道，鼠源性單克隆抗體治療AD可以達(dá)到和主動(dòng)免疫相似療效的結(jié)果。

Rothwell 等(1995年)報(bào)道，TNF-α對(duì)神經(jīng)元的營養(yǎng)和毒性作用與其在腦內(nèi)的濃度、位置及持續(xù)時(shí)間相關(guān)，這與IL-1β對(duì)神經(jīng)元的雙重作用相似，TNF-α可以直接產(chǎn)生神經(jīng)毒性，也可釋放其他炎癥因子間接損傷神經(jīng)元。本研究發(fā)現(xiàn)，治療后APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠血液及腦內(nèi)TNF-α含量均明顯減少。同時(shí)，炎癥反應(yīng)隨淀粉樣斑塊的消退而減少，提示炎癥反應(yīng)和淀粉樣斑塊形成可能密切相關(guān)，此結(jié)果與Wirths等[2]報(bào)道相似，進(jìn)一步證明“腦內(nèi)炎癥反應(yīng)隨淀粉樣斑塊形成而產(chǎn)生”的研究結(jié)論。

正常人及AD患者血清中均含抗Aβ抗體。與AD患者相比，正常人血清中的抗體滴度更高，是抗Aβ抗體的“天然多克隆抗體庫”。研究發(fā)現(xiàn)，血清中抗Aβ抗體可能具有清除老年斑或抑制老年斑形成的作用, 具有與主動(dòng)免疫誘導(dǎo)出的抗體相似的體外作用,顯示出潛在的AD治療價(jià)值[3-4]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)中含有高滴度的抗Aβ抗體，而且用有學(xué)者使用含抗Aβ抗體的IVIG治療8例AD患者取得良好療效，患者的認(rèn)知功能得以改善，且其記憶下降速度明顯減緩[5]。流行病學(xué)調(diào)查也發(fā)現(xiàn)含有抗Aβ抗體的IVIG可以預(yù)防AD的發(fā)生[6]。一直以來，被動(dòng)免疫的缺點(diǎn)在于生產(chǎn)單克隆抗體花費(fèi)巨大，且需要反復(fù)注射，針對(duì)抗體的免疫反應(yīng)不確定，而人源化抗Aβ抗體似乎是合理的揚(yáng)長避短，達(dá)到治療AD的目的可行性方法之一。本研究發(fā)現(xiàn)，人源化抗Aβ抗體與鼠源性抗體在治療AD療效相近，而在抗體的獲取、提純更具優(yōu)勢(shì)。雖然目前針對(duì)人源化抗Aβ抗體應(yīng)用于AD的治療還有具體結(jié)合位點(diǎn)、作用機(jī)制和通路、最佳效價(jià)沒有完全清晰以及遠(yuǎn)期有無并發(fā)癥等問題，尚需要進(jìn)一步去討論和解決，但總體上看，人源化抗Aβ抗體在免疫治療AD方面有著得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)，避免了合成Aβ單克隆抗體所需要的高昂成本，避開了主動(dòng)免疫的不良反應(yīng)，在體外試驗(yàn)有效的基礎(chǔ)上，如AD轉(zhuǎn)基因鼠的在體研究能取得成功，將為抗Aβ抗體進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)奠定可靠的基礎(chǔ)。

表1 3組APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠血清及腦組織TNF-α含量比較

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