Smad3磷酸化促進潰瘍性結(jié)腸炎的黏膜修復

陳婷婷 鄭豐平 譚嗣偉 陶金 吳斌

潰瘍性結(jié)腸炎 (UC) 是一種以直腸、結(jié)腸黏膜及黏膜下層慢性非特異炎癥為特征的腸道疾病。目前，對UC的發(fā)病機制研究很多，但仍未闡明。當前的研究表明UC的發(fā)病與環(huán)境、遺傳、免疫等多個因素有關，特別是與免疫因子異常關系密切[1]。作為一種多效能生長因子, 轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGF-β) 在腸道免疫平衡中發(fā)揮著不可替代的作用，其可通過下調(diào)過度的免疫應答反應從而抑制炎癥的發(fā)生與發(fā)展[2]。Smads家族成員是TGF-β下游的信號蛋白分子, Smad3是其關鍵始動因子。故本研究建立了小鼠UC模型，試圖探索結(jié)腸黏膜損傷與修復過程以及Smad3在TGF-β信號通路中的作用。

材料與方法

一、實驗動物

無特定病原體(SPF)級C57BL/6小鼠60只，雄性，周齡8周，體質(zhì)量20～25 g，購自中山大學北校區(qū)動物實驗中心。

二、主要試劑

葡聚糖硫酸鈉 (MP Biomedicals)、蘇木素-伊紅染料 (中杉金橋)、TUNEL試劑盒(Roche)、p-Smad3和Smad3抗體 (Cell Signaling Technology)、cleaved caspase-3抗體 (Cell Signaling Technology)、TGF-β抗體 (Abcam)、β-actin抗體 (Sigma)、Ki67抗體及PCNA抗體 (Santa Cruz)、DAB顯色液(DAKO)。

三、實驗方法

1.UC小鼠模型建立

小鼠隨機分為6組，每組10只。小鼠自由飲用3%DSS 5 d建立急性UC模型，后改為飲用正常蒸餾水修復。分別在3%DSS 5 d，飲水修復1、2、3、4周時處理小鼠。

2.小鼠疾病活動指數(shù)評估

每日觀察記錄小鼠的狀態(tài)、飲食、活動、體質(zhì)量、大便以及死亡情況。稱量體質(zhì)量，觀察糞便性狀及糞便隱血情況進行疾病活動指數(shù)評分：體質(zhì)量正常積分為0，體質(zhì)量減輕1%～5%為1，減輕5%～10%為2，減輕10%～20%為3，減輕大于20%積分為4；大便成形積分為0，糊狀/半成形為1，稀便為4；大便潛血陰性積分為0，大便潛血陽性為2，肉眼血便為4。將三者總分相加，得出每只小鼠的疾病活動指數(shù)[3]。

3.標本采集與處理

10%水合氯醛麻醉后行開腹手術，迅速剖取結(jié)腸，沿腸系膜剪開，預冷生理鹽水漂洗后，觀察炎癥及潰瘍情況。結(jié)腸組織放入10%福爾馬林中固定制作成石蠟標本或于冰上刮取結(jié)腸黏膜，保存于液氮中，待提取蛋白質(zhì)。

4.組織學分析

病理標本常規(guī)石蠟包埋，HE染色，觀察組織學改變并評分[3]。結(jié)腸黏膜組織結(jié)構(gòu)正常積分為0；中度黏膜炎癥反應但無糜爛和潰瘍積分為1；黏膜炎癥反應伴有糜爛積分為2；黏膜炎癥伴有小于1.0 mm潰瘍積分為3；伴有1.0～3.0 mm潰瘍積分為4；伴有大于3.0 mm潰瘍積分為5。

5.TUNEL檢測及凋亡指數(shù)

參照Roche公司產(chǎn)品說明書進行TUNEL檢測，細胞核呈棕褐色為陽性染色。每張切片隨機選取20個視野，計算凋亡細胞數(shù)和上皮細胞總數(shù)，凋亡指數(shù)=凋亡細胞數(shù)/上皮細胞總數(shù)×100%。

6.免疫組織化學染色

Ki67、TGF-β常規(guī)免疫組織化學染色，細胞核呈棕褐色為陽性染色。增殖指數(shù)統(tǒng)計：每張切片隨機選取100個隱窩，計數(shù)Ki67陽性細胞數(shù)及隱窩細胞總數(shù)，增殖指數(shù)=陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。TGF-β信號結(jié)果分析：每張切片隨機取20個視野，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行結(jié)果分析，測量陽性染色面積及平均光密度(以OD值表示)。

7.結(jié)腸黏膜總蛋白提取及蛋白質(zhì)電泳

按照總蛋白提取裂解液說明書提取結(jié)腸黏膜組織總蛋白，分離蛋白樣品并電泳。電泳印跡于PVDF膜上，牛奶封閉，相應抗體孵育，暗房曝光。采用Image J 圖像分析軟件行條帶灰度值分析，以內(nèi)參β-actin為參照(磷酸化蛋白以對應總蛋白為參照)，計算蛋白相對表達量。

四、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、 小鼠UC疾病活動指數(shù)的分析

小鼠飲用3%DSS 3天時，開始出現(xiàn)體毛凌亂、懶動。飲用DSS 5天時體質(zhì)量開始輕微下降，大便不成形，隱血陽性，無肉眼血便。停用DSS改為正常飲水修復第4天時小鼠狀態(tài)最差，匍匐不動，體質(zhì)量降至最低，肛門處有血跡。然后體質(zhì)量開始上升，大便性狀轉(zhuǎn)好，肉眼血便逐漸消失。于修復2周時恢復至原始體質(zhì)量后并繼續(xù)上升，大便轉(zhuǎn)為正常。正常對照組體質(zhì)量則逐步上升，大便正常成形，無肉眼血便，疾病活動指數(shù)見圖1。

圖1 小鼠UC疾病活動指數(shù)圖

二、 組織病理學的改變

正常組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，腺體排列規(guī)則，無炎癥細胞浸潤及糜爛或潰瘍(見圖2A)。損傷期時，可見多灶性小潰瘍，隱窩被破壞，腺體正常結(jié)構(gòu)消失，伴有廣泛炎癥細胞浸潤(見圖2B)。修復1周時，黏膜局限灶性糜爛、小潰瘍伴鄰近上皮細胞再生，部分腺體開始修復，炎癥細胞仍廣泛浸潤(見圖2C)。修復2周時，廣泛上皮細胞再生，隱窩增生、扭曲變形伴以淋巴、單核細胞為主的慢性炎癥細胞浸潤(見圖2D)。修復3周時，上皮細胞連續(xù)完整，大部分腺體結(jié)構(gòu)完整，少量淋巴、單核細胞浸潤(見圖2E)。修復4周時，結(jié)腸結(jié)構(gòu)恢復至正常，上皮連續(xù)完整，腺體排列規(guī)則，無明顯炎癥細胞浸潤(見圖2F)。對各組小鼠進行組織學評分顯示損傷期組、修復1、2周組評分均高于正常組(P<0.05)，修復3、4周組與正常組無明顯差異，損傷期組與修復1周組差異無統(tǒng)計學意義，而修復2、3、4周組評分均低于損傷期與修復1周組，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，見圖2。

圖2 小鼠結(jié)腸黏膜組織學表現(xiàn)及組織學評分(HE染色，×200)

三、 結(jié)腸組織黏膜凋亡與增殖情況

TUNEL染色顯示凋亡信號主要集中于上皮細胞。損傷期和修復1、2周時，上皮細胞凋亡較對照組均明顯增加(P<0.05)，其中，損傷期時上皮細胞凋亡指數(shù)達到最高值，與各修復組相比均有明顯差別(P<0.05)。修復3、4周時凋亡指數(shù)則明顯減少，與正常對照組無明顯差異，見圖3。結(jié)腸增殖情況利用Ki67免疫組織化學染色，結(jié)果顯示增殖的細胞主要位于隱窩底部和中部，少量見于上皮細胞和間質(zhì)炎癥細胞。損傷期時細胞增殖指數(shù)較正常組明顯減少(P<0.05)，修復1周時開始上升，至3周時達到峰值，4周時下降恢復至正常對照組水平，見圖4。

圖3 小鼠結(jié)腸黏膜TUNEL染色及凋亡指數(shù)(×200)

四、 結(jié)腸組織TGF-β，p-Smad3及相關蛋白質(zhì)表達情況

TGF-β免疫組織化學染色顯示信號主要位于結(jié)腸黏膜固有層炎癥細胞。各實驗組TGF-β的表達量均明顯增多，于損傷期及修復2周時最高。陽性信號經(jīng)相關軟件分析示各實驗組表達量均顯著高于正常對照組(P<0.05，見圖5)。同時行蛋白質(zhì)印跡檢測，結(jié)果顯示各實驗組TGF-β蛋白的表達量較正常對照組均明顯增多，其變化趨勢與免疫組織化學結(jié)果一致，而p-Smad3的蛋白質(zhì)表達于損傷期時顯著減少，而修復期重新被激活，修復1周時開始上升，至修復2周達高峰后恢復至正常水平。促凋亡蛋白caspase-3的激活于損傷期時表達明顯上調(diào)，此后逐漸下降至正常水平，而增殖細胞核抗原(PCNA)在損傷期明顯被抑制，于修復期逐漸恢復至正常水平，這與Ki67免疫組織化學染色趨勢相一致，見圖6。

討 論

UC作為一種慢性非特異性結(jié)腸炎疾病，其發(fā)病機制尚未明確，目前認為主要與免疫反應異常、遺傳易感性、環(huán)境及精神等多種因素密切相關[4]。當前對UC的研究主要集中在對其發(fā)病機制的探索上，而對其病程中結(jié)腸黏膜的損傷與修復的過度轉(zhuǎn)化中的機制研究則比較少見。故本實驗采用小鼠自由飲用3%DSS 5天后再改為飲用正常水來探索UC自身修復的組織病理學機制。實驗發(fā)現(xiàn)小鼠疾病活動變化情況與組織病理學改變并未完全同步。在飲用3%DSS 5天時，黏膜損傷嚴重，但小鼠狀態(tài)尚可，未出現(xiàn)肉眼血便，體質(zhì)量輕微下降。在停用DSS的第4天，小鼠疾病活動指數(shù)最高，此時狀態(tài)最差，體質(zhì)量降至最低，肛門處有血跡。修復1周時，結(jié)腸黏膜層仍有大量炎癥細胞浸潤，但小鼠整體狀態(tài)則開始出現(xiàn)好轉(zhuǎn)趨勢，其體質(zhì)量開始上升，肉眼血便消失。修復2周時，雖然腸黏膜并未修復完整，但小鼠體質(zhì)量已恢復到原始水平，成形大便多見，修復3周時結(jié)腸黏膜基本修復完整。

腸道黏膜上皮細胞增殖分化是一個動態(tài)變化的過程, 腸黏膜上皮維持穩(wěn)定依賴于上皮細胞增殖和凋亡間平衡。我們前期的研究表明，腸黏膜細胞的凋亡失控是UC導致腸黏膜損傷的主要原因[3]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，小鼠飲用3%DSS 5天時，黏膜細胞凋亡數(shù)達到最高值，而停用DSS后，凋亡細胞數(shù)開始減少，至修復3周時與正常對照組無明顯差異。相關研究表明，UC活動期時，黏膜上皮細胞凋亡速率明顯增加, 同時伴隨著隱窩細胞過度增殖[5]。然而本研究通過對增殖抗原的檢測，發(fā)現(xiàn)損傷期時增殖細胞數(shù)明顯減少，且此階段主要是炎癥細胞的增殖，但在修復開始第1周后增殖的腸黏膜細胞顯著增多并在修復趨于完成時恢復至正常水平，這些研究結(jié)果證明了UC中，腸黏膜細胞增殖數(shù)的增加可加快結(jié)腸受損黏膜的修復。

圖4 小鼠結(jié)腸黏膜Ki67免疫組織化學染色及增殖指數(shù)(×200)

大量研究表明，組織在免疫損傷、炎癥反應到細胞增生等多個環(huán)節(jié), 都有賴于各種各樣的細胞因子的調(diào)控[6]。其中，TGF-β作為一種具有多種生物學活性的細胞因子，廣泛表達于各種免疫細胞，其在細胞增殖、損傷修復、潰瘍愈合及免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要作用[7]。早期的研究就表明TGF-β敲除小鼠因出現(xiàn)多系統(tǒng)慢性炎癥反應而導致早期死亡，表達TGF-βRII突變體的轉(zhuǎn)基因小鼠在有致病原環(huán)境中能自發(fā)產(chǎn)生非特異抗原的結(jié)腸炎, 而在非致病原環(huán)境中對DSS誘導的炎癥性腸病易感，導致結(jié)腸損傷修復削弱[8]。在TGF-β信號傳導途徑中，Smads家族作為TGF-β下游的重要信號蛋白分子，是將TGF-β信號從細胞外轉(zhuǎn)導到細胞核內(nèi)的關鍵步驟,其中尤以Smad3最為重要，其在整個信號通路中發(fā)揮著至關重要的作用[9]。Smad分子表達異常導致TGF-β/Smad信號通路傳導障礙使得TGF-β抑制促炎因子活化,維持腸黏膜免疫耐受作用受損進而促進UC的發(fā)生發(fā)展。相關研究顯示，Smad3基因敲除小鼠受損腸黏膜愈合能力被抑制[10]。Smad3基因的失控可能是創(chuàng)面愈合延遲、不愈合或過度愈合的原因。根據(jù)以上的資料，本研究中展開了對TGF-β/Smad3信號通路的相關研究，探討是否TGF-β/Smad3信號通路參與了結(jié)腸炎的受損黏膜修復過程。結(jié)果表明TGF-β且呈動態(tài)變化，在損傷及修復期均明顯升高，修復1周和修復末期雖然下降但仍高于正常水平，提示TGF-β不僅與黏膜的損傷有關，并參與了損傷后修復的過程中。但是其下游的Smad3磷酸化蛋白表達在損傷期明顯被抑制，這種現(xiàn)象可能主要是由于損傷期時促炎癥蛋白Smad7的過度表達而抑制抗炎的Smad3活化[11-12]。而修復期的Smad3被明顯活化，與隱窩細胞增殖變化趨勢相一致，與此同時，上皮細胞凋亡減少，這提示TGF-β通過激活Smad3磷酸化參與UC黏膜修復過程。

圖5 小鼠結(jié)腸黏膜TGF-β免疫組織化學染色及其平均光密度值(×200)

圖6 小鼠結(jié)腸黏膜組織相關蛋白質(zhì)表達情況的檢測及灰度比值

綜合上述，本實驗通過對UC黏膜損傷與修復過程中組織病理學，細胞凋亡與增殖及TGF-β, p-Smad3相關蛋白的研究來揭示UC的轉(zhuǎn)化發(fā)展規(guī)律，闡明了TGF-β/Smad3信號通路在黏膜損傷與修復中的作用，為以后將Smad3作為靶向治療UC提供了堅實的科學基礎。

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