液質(zhì)聯(lián)用法分析王老吉涼茶中的3種有效成分

朱平川，岑衛(wèi)健，范曉蘇

（1.亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣西大學(xué)），廣西 南寧530004；2.廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧530004）

王老吉涼茶是著名的廣東涼茶之一，由金銀花、菊花、仙草、雞蛋花、夏枯草、布渣葉和甘草7味藥材組成，具有清熱解毒、涼血排毒等功效.2006年國(guó)務(wù)院將涼茶批準(zhǔn)為國(guó)家級(jí)非物質(zhì)文化遺產(chǎn)［1］.涼茶中含有多種中藥有效成分，綠原酸具有顯著的抗氧化、降血糖血壓以及抗菌消炎、抗腫瘤等多種藥理活性［2］，異綠原酸具有抗菌、抗炎、促凝血、抗氧化以及降血脂等作用［3］，甘草酸屬于皂苷類成分，甘草酸能達(dá)到增加人體免疫功能作用［4］，但目前對(duì)涼茶中藥有效成分的報(bào)道比較少，且大多采用液相色譜法［5］.曹英華等采用高效液相色譜法測(cè)定［6］涼茶中綠原酸、新橙皮苷、甘草酸的含量，鄧潔薇［7］對(duì)鄧?yán)蠜霾桀w粒進(jìn)行了的HPLC指紋圖譜研究.在涼茶以及其他飲料中的綠原酸、異綠原酸C、甘草酸這3種物質(zhì)含量的同時(shí)分析研究尚少見(jiàn)有報(bào)道.

色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有專屬靈敏、快速等特點(diǎn)，已成功用于成分測(cè)定［8］，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)更是成分分析中定性和定量分析的有力工具［9-10］，并且越來(lái)越廣泛地運(yùn)用于食品與飲料中的成分研究［11］，本工作建立了采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)這3種物質(zhì)含量的方法，該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便快速，已成功地用于實(shí)際樣品的分析.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑 儀器：1290Infinity LC System，6460Triple Quad LC／MS，美國(guó)Agilent公司；ME 215S電子天平，德國(guó)Sartorius公司；Eppendorf Centrifuge 5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；Synthesis A10TM超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司；KQ2200DV超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司.試劑：甲醇、乙腈、甲酸（色譜純），美國(guó)Fisher公司，對(duì)照品綠原酸、異綠原酸C、甘草酸（四川省維克奇生物科技有限公司），實(shí)驗(yàn)用水為超純水；樣品王老吉涼茶（廣州王老吉健康產(chǎn)業(yè)有限公司）.

1.2 溶液配制 對(duì)照品儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取綠原酸、異綠原酸C、甘草酸對(duì)照品各10.0mg，分別用甲醇溶解并定容至10mL容量瓶中，配成1.00mg／mL儲(chǔ)備液，于4℃下保存，使用前用甲醇稀釋到所需的濃度.

樣品溶液：準(zhǔn)確量取王老吉涼茶1mL，用甲醇稀釋10倍，取稀釋的樣品1mL置于1.5mL的EP管中，于12 000rpm下離心10min，經(jīng)0.22μm的微孔過(guò)濾膜過(guò)濾即可作為樣品溶液.

1.3 色譜條件 采用 Agilent Zorbax RRHD Eclipse Plus C18（2.1×50.0mm，1.8μm）色譜柱；以含甲醇（A）-0.1%甲酸的水溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫程序：0～3min，90%～55%B；3.0～4.5min，55%～30%B；4.5～6.0min，30%～10%B；6～8min，10%～0%B；8～9min，0%B；9～10min，0%～90%B.流速為0.30mL／min，進(jìn)樣量：1μL.

1.4 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧電離源，干燥氣體，霧化氣體，鞘氣氣體均為N2，毛細(xì)管電壓為4 000 V，噴嘴電壓為0V.采用多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），3種目標(biāo)組分的其他質(zhì)譜分析參數(shù)見(jiàn)表1.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化 對(duì)甲醇-水和乙腈-水流動(dòng)相進(jìn)行了考察，結(jié)果表明使用甲醇-水體系作流動(dòng)相時(shí)靈敏度高于乙腈-水體系，且分離效果更好.當(dāng)流動(dòng)相中不添加甲酸時(shí)，綠原酸、異綠原酸C兩個(gè)物質(zhì)峰有嚴(yán)重的拖尾，且同時(shí)發(fā)現(xiàn)添加的甲酸的濃度會(huì)影響各組分的檢測(cè)靈敏度，本方法采用在流動(dòng)相甲醇-0.1%甲酸水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫.

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 分別對(duì)比了正離子和負(fù)離子檢測(cè)模式，發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)條件下采用綠原酸、異綠原酸C在負(fù)離子模式下檢測(cè)靈敏度高，而甘草酸在正離子模式的檢測(cè)靈敏度較高.在MRM模式下，對(duì)選定的各待測(cè)物的母離子和定量子離子進(jìn)行各種參數(shù)的優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 3種成分的部分質(zhì)譜分析參數(shù)

2.3 色譜與質(zhì)譜行為 在優(yōu)化的色譜質(zhì)譜條件下，被測(cè)組分間可獲得良好的分離，色譜圖見(jiàn)1.根據(jù)峰的保留時(shí)間及質(zhì)譜信息進(jìn)行定性，二級(jí)質(zhì)譜特征離子圖譜見(jiàn)圖2.從圖2中，可以看出綠原酸、異綠原酸C分子離子峰為［M-H］-、甘草酸的分子離子峰為［M＋Na］＋；從圖2中選出各物質(zhì)響應(yīng)最強(qiáng)且穩(wěn)定的子離子作為定量子離子，因此進(jìn)行多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)時(shí)，分別對(duì)綠原酸（m／z為191.1）、異綠原酸C（m／z為353.0）、甘草酸（m／z為669.3）的碎片離子進(jìn)行監(jiān)測(cè).

圖1 對(duì)照品（A）和樣品（B）的MRM色譜圖

圖2 3種標(biāo)準(zhǔn)品的二級(jí)質(zhì)譜圖

表2 3種組分的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限

2.4 線性關(guān)系及檢出限精密吸取3種對(duì)照品的儲(chǔ)備液，甲醇溶液稀釋，配制一系列不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品，混合，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定，重復(fù)3次.以被測(cè)組分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積的平均值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，以信噪比（S／N）等于3為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)得3種待測(cè)組分的檢出限，見(jiàn)表2，從表中可看出，各化合物的響應(yīng)值與濃度間均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系.

2.5 精密度、穩(wěn)定性以及重復(fù)性 取同一批次待測(cè)樣品，按“1.2”下供試樣品溶液的方法制備樣品溶液，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.2%～1.8%，結(jié)果表明該方法有較好的精密度.

取同一批次樣品，按“1.2”下供試樣品溶液的方法制備樣品溶液，在優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件下，分別于0，2，4，6，8，10h進(jìn)樣測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.3%～2.1%，結(jié)果表明供試品溶液在10h內(nèi)穩(wěn)定.

同一批次待測(cè)樣品隨機(jī)取6份，按“1.2”下供試樣品溶液的方法制備樣品溶液，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下分析，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.6%～2.5%.結(jié)果表明供試樣品重復(fù)性良好.

2.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 分別精密量取已知這3種組分含量的同一批次王老吉涼茶各1mL，共9份，每組3份，按“1.2”供試樣品溶液的制備方法將樣品稀釋10倍來(lái)制備樣品溶液，加入高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品.在最優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下分析.3種成分的平均回收率根據(jù)峰面積代入回歸方程計(jì)算得出，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3.在添加3個(gè)質(zhì)量濃度的水平下，3種成分的加標(biāo)回收率為94.7%～103%，RSD均不大于1.9%，可以滿足實(shí)際樣品的測(cè)定要求.

表3 3種組分在樣品中的加標(biāo)回收率（n＝3）

2.7 樣品分析 分別精密稱取不同批次的樣品，按“1.2”下供試樣品溶液的方法制備樣品溶液，按上述優(yōu)化好的條件進(jìn)行樣品測(cè)定，把各組分峰面積代入回歸方程計(jì)算得到樣品中3種組分的含量，結(jié)果見(jiàn)表4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法可用于綠原酸、異綠原酸C、甘草酸3種有效成分含量的同時(shí)測(cè)定.

表4 樣品測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

采用UPLC-MS／MS技術(shù)建立了同時(shí)測(cè)定王老吉涼茶中綠原酸、異綠原酸C、甘草酸3種藥效成分含量的分析方法.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法具有靈敏度好、定量能力強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、快速、簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，已成功用于王老吉涼茶中上述3種有效成分含量的同時(shí)測(cè)定，可以為王老吉涼茶的質(zhì)量控制和中草藥療效以及藥代動(dòng)力學(xué)等相關(guān)研究提供新的參考方法.

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