束縛應(yīng)激對(duì)D-氨基半乳糖聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)小鼠肝損傷的保護(hù)作用

盧靜，李夢(mèng)，陳柏安，孫泉，翟亞南，王晶晶，孟霞，鄭世軍

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100094，2.首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，北京 100069)

應(yīng)激是機(jī)體受到刺激后產(chǎn)生的非特異性適應(yīng)性反應(yīng)，是一種生理和心理對(duì)環(huán)境的抵抗?fàn)顟B(tài)，以維護(hù)機(jī)體的穩(wěn)定。人類在生活、工作中，經(jīng)常處于無(wú)法控制的擁擠和緊張狀態(tài)，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行定時(shí)和較低強(qiáng)度的束縛能夠較好地模擬人類的這種狀態(tài)。此外，束縛應(yīng)激還可以模擬宇航員在宇宙飛行中的應(yīng)激變化。本實(shí)驗(yàn)采用特定的束縛工具，對(duì)D-氨基半乳糖聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型給予短暫的束縛刺激，通過(guò)檢測(cè)ALT、AST和病理染色觀察束縛應(yīng)激對(duì)肝損傷的影響，對(duì)肝病治療有一定參考價(jià)值，同時(shí)對(duì)重癥肝病患者認(rèn)識(shí)疾病、配合治療等有積極的指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)BALB/c小鼠48只，雄性，體重18～20 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)有限公司[SCXK(京)2012-0001]，在首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部屏障環(huán)境 [SYXK(京)2010-0020] 飼養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)操作程序均經(jīng)過(guò)首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)為2011-X-90)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

D-氨基半乳糖(Nanjing Boyuan Pharmatech Co., Ltd，20100521)；脂多糖(美國(guó)Sigma公司，L2880，10 mg)；α-SMA免疫組化試劑盒(Abgent, CA92121)。

1.3 動(dòng)物分組與模型制備

將BALB/c小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(con，12只)、應(yīng)激對(duì)照組(str，12只)、模型組(D+L，12只)，束縛應(yīng)激組(D+L+str，12只)。①con組給以正常飲食，飼養(yǎng)8周；②str組將小鼠裝入特制的束縛應(yīng)激離心管(選擇50 mL離心管，直徑比小鼠腹圍寬松，但又使其不能轉(zhuǎn)身。在凍存管底和凍存管上鉆孔，以便動(dòng)物呼吸和散熱，凍存管蓋部鉆一孔，使動(dòng)物尾部能自由活動(dòng)。)，每次30 min，1次/2天，連續(xù)8周；③D+L組腹腔注射D+L注射液(1800 mg D-氨基半乳糖加入54 mL生理鹽水后，加入6 mL濃度為20 μg/mL脂多糖，配置成30 mg/mL D-氨基半乳糖和2μg/mL脂多糖的混合溶液)，10 μL/g，1次/2天，連續(xù)注射8周；④D+L+str組同D+L組等時(shí)等量給予D+L混合溶液后，同str組給予束縛應(yīng)激，連續(xù)8周。

1.4 樣本處理

實(shí)驗(yàn)第8周，各組小鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉(0.35 mL/100 g)；麻醉后，眼眶動(dòng)靜脈采血法采血；采血后，離心取血清(3000 g/min，10 min)；采血后，頸椎脫臼處死并摘取肝臟；剪取肝臟最大葉1/3，置于4% 甲醛溶液中固定，常規(guī)方法脫水、透明、包埋后制成蠟塊并切片備用。

1.5 AST、ALT檢測(cè)

日立7180全自動(dòng)血生化儀檢測(cè)AST、ALT血清濃度。

1.6 肝臟組織石蠟切片HE染色及Masson染色

將肝臟組織石蠟切片進(jìn)行水化處理后(Leica AutoStainer XL自動(dòng)染色儀)，分別使用常規(guī)法進(jìn)行HE染色處理及Masson染色試劑盒進(jìn)行Masson染色處理，中性樹(shù)膠封片后使用Nikon數(shù)字顯微照相機(jī)拍攝照片。

1.7 肝纖維化程度評(píng)判

(1)采用盲評(píng)法，HE染色切片，50 μm倍光鏡下，每組隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行評(píng)分。標(biāo)準(zhǔn)如下：“-”無(wú)成纖維細(xì)胞增生，計(jì)0分；“+”匯管區(qū)擴(kuò)大，有少量成纖維細(xì)胞增生，計(jì)1分；“++”匯管區(qū)成纖維細(xì)胞增生并向小葉內(nèi)延伸，呈較窄較短的纖維素條，計(jì)2分；“+++”匯管區(qū)成纖維細(xì)胞大量增生并向小葉內(nèi)明顯延伸，形成纖維隔伴有小葉結(jié)構(gòu)紊亂，計(jì)3分。

(2)Masson染色半定量分析，Masson染色切片，50 μm倍光鏡下，使用Nikon數(shù)字顯微照相機(jī)進(jìn)行吸光度測(cè)量，每組隨機(jī)選取6個(gè)視野。

1.8 肝組織α-SMA免疫組化法檢測(cè)吸光度值

組織切片水化后，常規(guī)免疫組化法染色，50 μm倍光鏡下，使用Nikon數(shù)字顯微照相機(jī)進(jìn)行吸光度測(cè)量，每組隨機(jī)選取6個(gè)視野。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD) 表示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用 SPSS 13.0 軟件進(jìn)行處理，各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，并作兩兩比較，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 血清ALT、AST變化

如表1示：第8周模型組小鼠ALT濃度與正常對(duì)照組相比極顯著增加(P=0.007)；與模型組比較，束縛應(yīng)激組小鼠ALT顯著降低(P=0.014)。

表1 第8周BALB/c小鼠血清ALT、AST濃度±s)

2.2 病理學(xué)觀察

HE染色顯示(見(jiàn)圖1，彩插15)：第8周時(shí)，正常組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰完整，上皮細(xì)胞呈多邊型，排列整齊有序，細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核分染清晰，細(xì)胞質(zhì)呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，結(jié)構(gòu)完整；應(yīng)激對(duì)照組與正常組比較，結(jié)構(gòu)清晰，排列有序，未見(jiàn)明顯異常；在100 μm倍鏡下可以看見(jiàn)，D+L組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)明顯紊亂，結(jié)節(jié)性增生出現(xiàn)較多，該結(jié)節(jié)性增生區(qū)域50 μm倍鏡下可見(jiàn)肝細(xì)胞細(xì)胞核出現(xiàn)大量濃縮，甚至溶解、壞死，壞死細(xì)胞被枯否氏細(xì)胞浸潤(rùn)，對(duì)壞死細(xì)胞進(jìn)行吞噬；D+L+stress組未見(jiàn)明顯病理變化，10倍鏡下未見(jiàn)結(jié)節(jié)性增生，40倍鏡下未見(jiàn)肝上皮細(xì)胞壞死及枯否氏細(xì)胞浸潤(rùn)，與正常組比較無(wú)明顯異常。

Masson染色顯示(見(jiàn)圖2，彩插15)：第8周時(shí)，100 μm倍鏡下正常對(duì)照組肝細(xì)胞間可見(jiàn)少量淡藍(lán)色索狀染色；應(yīng)激對(duì)照組與正常對(duì)照組比較，未見(jiàn)明顯差異；D+L組肝小葉出現(xiàn)大量條索狀呈結(jié)節(jié)樣深色藍(lán)染，50 μm倍鏡下可見(jiàn)結(jié)節(jié)樣深色藍(lán)染主要出現(xiàn)在肝上皮細(xì)胞大量變性壞死區(qū)域；與D+L組相比，D+L+stress組藍(lán)染區(qū)域明顯減少，10倍鏡下可見(jiàn)散在淡藍(lán)染色，但無(wú)明顯結(jié)節(jié)樣藍(lán)染，40倍鏡下可見(jiàn)淡藍(lán)染色部位集中在肝上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中。

2.3 肝纖維化程度評(píng)價(jià)

第8周HE染色纖維化程度評(píng)判(如圖3所示)：與對(duì)照組比較，D+L組纖維化評(píng)分極顯著升高(P=0.000)；與D+L組比較，D+L+str組纖維化評(píng)分顯著降低(P=0.011)。

第8周Masson染色膠原吸光度統(tǒng)計(jì)(如圖4所示)：與con組比較，D+L組膠原吸光度極顯著升高(P=0.000)；與D+L組比較，D+L+str組膠原吸光度極顯著降低(P=0.000)。

2.4 肝組織α-SMA免疫組化染色。

第8周α-SMA免疫組化染色如圖5(彩插15)所示：與D+L組比較，D+L+stress組α-SMA陽(yáng)性顆粒吸光度值極顯著降低(P=0.000)(見(jiàn)圖6)。

圖3 肝組織病理評(píng)分

圖4 BALB/c小鼠肝組織Masson染色膠原吸光度

圖6 B/c小鼠肝組織α-SM A免疫組化吸光度

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與D+L組小鼠相比, 8周時(shí)D+L+stress組小鼠血清ALT顯著降低，同時(shí)HE染色顯示D+L+stress組小鼠肝臟未見(jiàn)明顯病理變化。Masson染色顯示D+L+stress組小鼠肝臟膠原及α-SM A吸光度值明顯低于D+L組小鼠。

由此可見(jiàn)，適當(dāng)束縛應(yīng)激能夠緩解慢性肝損傷，同時(shí)降低膠原在肝上皮細(xì)胞間質(zhì)中的堆積，減輕肝纖維化程度。孫燕等[1]的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果揭示，急、慢性束縛應(yīng)激均可顯著增加內(nèi)臟敏感性，并且應(yīng)激時(shí)主要表現(xiàn)為對(duì)非傷害性機(jī)械擴(kuò)張的內(nèi)臟敏感性增高，兩者具有相似性。

研究發(fā)現(xiàn)，在肝纖維化形過(guò)程中，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)激活是中心環(huán)節(jié)，而α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)是HSC活化的標(biāo)志物。肝損傷導(dǎo)致HSC增殖，并由靜止?fàn)顟B(tài)激活，轉(zhuǎn)變?yōu)楸磉_(dá)α-SMA的肌成纖維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞大量合成如Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、纖維連接蛋白等多種細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生[2-4]。反之，抑制HSC的活化(α-SMA表達(dá)降低)，就能顯著抑制纖維化進(jìn)程，減少膠原纖維堆積[5]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與D+L組小鼠相比, 8周時(shí)D+L+stress組小鼠膠原纖維的吸光度值顯著降低，同時(shí)α-SMA的表達(dá)量亦顯著減少。表明，束縛應(yīng)激很有可能是通過(guò)抑制HSC的活化，從而起到抑制肝纖維化的作用。然而，束縛應(yīng)激對(duì)肝臟影響的研究較少[6-8]，一般認(rèn)為束縛應(yīng)激是通過(guò)下丘腦-垂體-腎上腺軸，再加上自主神經(jīng)系統(tǒng)、傳出的下丘腦-腎上腺髓質(zhì)-腎上腺素和下丘腦-肝臟交感神經(jīng)干-去甲腎上腺素軸，依次釋放糖皮質(zhì)激素和兒茶酚胺類遞質(zhì)對(duì)肝臟產(chǎn)生影響[9]。究竟束縛應(yīng)激是否是通過(guò)糖皮質(zhì)激素和兒茶酚胺類遞質(zhì)對(duì)HSC的活化產(chǎn)生影響還不清楚，仍需進(jìn)一步研究。

以往研究顯示，束縛應(yīng)激具有明顯的加劇肝損傷的作用，其表現(xiàn)為應(yīng)激后血清ALT濃度顯著升高。Sree等[10]發(fā)現(xiàn)，CCl4造模后附加2.5 h高強(qiáng)度完全束縛應(yīng)激，其血清ALT濃度與單純CCl4造模相比，顯著增高，提示束縛應(yīng)激具有明顯的加劇CCl4致肝損傷作用。而本研究的結(jié)果顯示適當(dāng)程度的束縛應(yīng)激能夠減輕D+L誘導(dǎo)的小鼠肝損傷，經(jīng)HE染色和Masson染色可見(jiàn)束縛應(yīng)激可減輕小鼠肝細(xì)胞的損傷和肝纖維化的形成，生化檢測(cè)結(jié)果顯示束縛應(yīng)激可顯著降低肝損傷小鼠血清AST和ALT水平。造成這些差異可能有如下主要原因：① 采用的束縛應(yīng)激方式和強(qiáng)度不同。Sree等[10]發(fā)現(xiàn)，束縛應(yīng)激造成的肝損傷具有明確的時(shí)效性，束縛應(yīng)激小于2.5h時(shí)，肝損傷不明顯，而一旦大于這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，束縛應(yīng)激導(dǎo)致的肝損傷則爆發(fā)式的增長(zhǎng)。因而之前的束縛應(yīng)激持續(xù)時(shí)間一般都大于2.5h，有的研究更長(zhǎng)達(dá)18h[11]。而本實(shí)驗(yàn)采取的是低時(shí)間強(qiáng)度的束縛應(yīng)激(0.5 h)，大大小于以往研究。②采用的動(dòng)物模型不同。本研究中應(yīng)用常規(guī)的化學(xué)性肝損傷小鼠模型。Sree D、Abraham等[12]的研究應(yīng)用的是其他類型的動(dòng)物模型，因此不同的動(dòng)物模型對(duì)束縛應(yīng)激的反應(yīng)和敏感性都會(huì)不同。③束縛應(yīng)激對(duì)不同類型的肝損傷作用可能不同。④束縛應(yīng)激對(duì)肝臟的作用與肝臟的狀態(tài)相關(guān)。在本研究中束縛應(yīng)激對(duì)肝損傷具有顯著的緩解作用，但對(duì)處于健康狀態(tài)的正常肝臟無(wú)明顯作用。

本研究結(jié)果提示，適當(dāng)?shù)氖`應(yīng)激對(duì)肝損傷具有緩解作用，為將來(lái)研發(fā)非創(chuàng)傷性方法治療肝臟疾病提供了新的思路。

(本文圖1,2,5見(jiàn)彩插15)。

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