炎癥誘導(dǎo)的新型大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型的建立及Rb1的防治作用

樊繼山，劉丹寧，何翠瑤，李曉輝

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院藥學(xué)部，兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400014；

2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，重慶 400010；3.第三軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400038)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)的發(fā)病是多因素的，并且各因素之間的相互作用極其復(fù)雜。除了高脂血癥以外，越來(lái)越多的證據(jù)提示慢性持續(xù)的炎癥反應(yīng)在AS發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[1]。既往的資料顯示，在相同的血膽固醇水平下，不同患者動(dòng)脈粥樣硬化病變程度可以差異很大[2]；炎癥敏感性指標(biāo)C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)的升高與AS的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有密切的關(guān)系[3]；動(dòng)脈壁的慢性炎癥可以造成動(dòng)脈斑塊進(jìn)而促進(jìn)局部血栓形成而堵塞血管[4]，我們以往的體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)炎癥刺激可以明顯促進(jìn)泡沫細(xì)胞的生成，且傳統(tǒng)中藥三七總皂苷可通過(guò)其抗炎活性干預(yù)這一過(guò)程[5]，此外，我們通過(guò)正交試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷主要成分之一Rb1在其中發(fā)揮了重要作用[6]。因此我們?cè)谖癸暩咧暳系幕A(chǔ)上采用酵母多糖誘發(fā)持續(xù)性炎癥的方法誘導(dǎo)大鼠AS的形成，為深入探索炎癥反應(yīng)與AS之間的關(guān)系及其相關(guān)研究提供穩(wěn)定有效的動(dòng)物模型，并進(jìn)一步在此模型中觀察Rb1在體內(nèi)的抗AS作用及其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

酵母多糖(zymosan A，Zym)粉劑購(gòu)于Sigma公司。酵母多醣混懸液的配制：酵母多糖A粉劑與醫(yī)用液體石蠟按5 mg/mL比例混和,高頻電磁力攪拌器攪拌15 min制成懸濁液,置100℃水浴消毒80 min,冷卻后,放入4℃冰箱備用。給動(dòng)物注射前需將酵母多糖-液體石蠟混懸液加熱至40℃, 高頻電磁力攪拌器振蕩搖勻后方可使用。Rb1(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110704-200420，純度:98%)，蘇丹IV(中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司)，核因子κB(NFκB/P65)鼠單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，SP免疫組化試劑盒(北京中杉公司)，腫瘤壞死因子α(TNFα)、白細(xì)胞介素6(IL6)ELISA試劑盒(上海森雄公司)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 動(dòng)物分組、模型制備及取材

雄性SPF級(jí)SD大鼠，6～7周齡，體重230 ～250 g, 來(lái)源于第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(軍)2007-0015】，動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作在第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行【SYXK (軍) 2007-0037】，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。大鼠分為3組：對(duì)照組、模型組及Rb1干預(yù)組，每組12只，均喂食高脂飼料(高脂飼料配方：3% 膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油、81.3%基礎(chǔ)飼料)，自由飲水；實(shí)驗(yàn)共10周。

對(duì)照組：腹腔注射等量滅菌液體石蠟；模型組：在無(wú)菌條件下腹腔注射酵母多糖-液體石蠟混懸液20 mg/kg體重，注射后輕柔腹壁片刻，間隔3 d注射一次。Rb1干預(yù)組：在模型組基礎(chǔ)上每日腹腔注射Rb1(40 mg/kg)，若當(dāng)日需注射酵母多糖則在注射酵母多糖之前6h進(jìn)行。模型組動(dòng)物經(jīng)尾靜脈取血20 μL行白細(xì)胞計(jì)數(shù)，此后每24 h尾靜脈取血行白細(xì)胞計(jì)數(shù)，監(jiān)測(cè)炎癥反應(yīng)，記錄2次給藥期間的白細(xì)胞計(jì)數(shù)情況。所用器械、試劑和操作均注意無(wú)菌處理。

1.3 樣品的準(zhǔn)備

各組大鼠從腹腔注入l%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉，各組大鼠從左心室取血2 mL備用，繼之插管入升主動(dòng)脈．以120 cmH2O壓力灌注含1%多聚甲醛及1.25%戊二醛的0.1 mol/L磷酸緩沖液200 mL (pH7.4)。解剖后取下整段主動(dòng)脈，自升主動(dòng)脈、主動(dòng)脈弓、胸段、腹段，在3%的戊二醛中沿動(dòng)脈縱軸修剪為1.0 mm × 1.0 mm × 2.0 mm大小,繼續(xù)用3%戊二醛固定過(guò)夜用于透射電鏡檢測(cè)。另大鼠麻醉后處死，立即取主動(dòng)脈并以冷PBS清洗，用于蘇丹染色及切片進(jìn)行免疫組化檢測(cè)；DEPC水清洗用于提取RNA。

1.4 主動(dòng)脈標(biāo)本蘇丹染色

縱形剖開(kāi)血管，生理鹽水沖洗，4% 甲醛固定40～60min后，將血管取出生理鹽水沖洗，放入蘇丹IV染液中染色10 min(染液量是組織體積的5～6倍)，生理鹽水沖洗后將血管展平拍照觀察。

1.5 電鏡檢測(cè)

經(jīng)戊二醛固定后的標(biāo)本置于2%鋨酸進(jìn)行后固定,環(huán)氧樹(shù)脂包埋,超薄切片機(jī)切片,載膜銅網(wǎng)撈片,鉛鈾雙染,在TECNA-10透射電鏡(Philips, Holland)下觀察攝片。

1.6 RNA提取及real time PCR檢測(cè)

參照文獻(xiàn)進(jìn)行[7]，Trizol法提取總RNA，取2 μg總RNA經(jīng)DNase I處理后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，引物為上海生工生物公司合成(NFκB/P65：上游引物: 5′-GGAAATGTATGTTCCTAAGCTCGACAG-3′,下游引物: 5′-CGTGTCGCCGCCCGACCGAATCGACGGC-3′,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度: 172 bp； GAPDH:上游引物: 5′-TGGTGAAGGTCGGTGTGTGAACC-3′,下游引物: 5′-TTCCCATTCTCAGAATTGAC-3′,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度: 190 bp)。NF-κB mRNA表達(dá)水平以其與GAPDH的相對(duì)表達(dá)量來(lái)計(jì)算。

1.7 免疫組織化學(xué)

取主動(dòng)脈全長(zhǎng)，清除外膜結(jié)締組織后縱向剖開(kāi)，經(jīng) 4% 甲醛固定后，石蠟包埋，延動(dòng)脈的縱軸方向常規(guī)切片。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，顯微鏡下拍照后用“Image Pro Plus”圖象處理軟件進(jìn)行圖像分析，測(cè)定陽(yáng)性物質(zhì)表達(dá)面積和積分吸光度(IOD)。

1.8 TNFα、IL6水平測(cè)定

取血后靜置半小時(shí)，1500 r/min離心5min，分離出血清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。

1.9 統(tǒng)計(jì)處理

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析處理，P<0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果

模型組大鼠與實(shí)驗(yàn)前[(10.4±0.069)×103/mm3]比較，首次腹腔注射酵母多糖液后24 h[(12.6±0.17)×103/mm3] (P<0.05)白細(xì)胞即開(kāi)始升高，48h[(20.1±0.21)×103/mm3] (P<0.01)達(dá)到高峰并持續(xù)處于高水平至72 h[(12.8±0.12)×103/mm3] (P<0.05)，96 h [(11.3±0.14)×103/mm3] (P>0.05)后恢復(fù)正常水平，二次給藥后24h[(22.4±0.27)×103/mm3] (P<0.01)即明顯升高達(dá)高峰，48h[(20.8±0.18)×103/mm3] (P<0.01)、72h[(17.5±0.27)×103/mm3] (P<0.01)、96h[(12.7±0.19)×103/mm3] (P<0.05) 雖逐漸下降但與給藥前比較差異有顯著性，120h[(11.9±0.10)×103/mm3] (P>0.05)、144h [(10.2±0.10) ×103/mm3] (P>0.05) 后即二次給藥后5d時(shí)降至正常水平(見(jiàn)圖1)。

2.2 動(dòng)物一般情況、體重、血脂及大體標(biāo)本形態(tài)學(xué)結(jié)果

AS模型組在實(shí)驗(yàn)第二周前后，腹腔注射Zym后精神狀態(tài)及飲食欠佳, 表現(xiàn)為不活潑, 毛發(fā)不順, 少動(dòng), 攝食、飲水相對(duì)減少，體重有所減輕；三周后動(dòng)物精神狀態(tài)和進(jìn)食有所恢復(fù)，隨著實(shí)驗(yàn)周期的延長(zhǎng)，逐漸好轉(zhuǎn)，體重與其他組大鼠無(wú)顯著差別。實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束時(shí)模型組大鼠血清總膽固醇及低密度脂蛋白水平均明顯高于對(duì)照組，而甘油三酯水平差異無(wú)顯著性(見(jiàn)表1)。大體標(biāo)本形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈表面光滑有光澤；模型組動(dòng)物主動(dòng)脈肉眼觀察見(jiàn)較多紅染的斑片狀及與縱軸垂直的紅染脂紋突起于動(dòng)脈表面；Rb1干預(yù)組見(jiàn)動(dòng)脈壁毛糙不平,但僅見(jiàn)少量點(diǎn)片狀紅染改變，較模型組改變明顯減輕(圖2見(jiàn)彩插7)。

表1 AS模型大鼠血清中TG、TC、LDL水平的變化±s，n =6)

2.3 電鏡觀察

模型組可見(jiàn)內(nèi)膜下層的動(dòng)脈硬化性病變的典型特征性細(xì)胞-泡沫細(xì)胞。對(duì)照組動(dòng)脈壁內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)完好，內(nèi)膜下無(wú)泡沫細(xì)胞形成。Rb1組可見(jiàn)內(nèi)膜下浸潤(rùn)的單核細(xì)胞，但未發(fā)現(xiàn)泡沫細(xì)胞(見(jiàn)圖3)。

2.4 Real time PCR結(jié)果

與對(duì)照組比較模型組NFκB/p65 mRAN的表達(dá)明顯增高，Rb1干預(yù)后能顯著降低NFkB/p65 mRAN的表達(dá)量(見(jiàn)圖4)。

注：A.對(duì)照組; B.模型組,箭頭所指為細(xì)胞內(nèi)吞噬的脂滴; C.Rb1組。

注：與對(duì)照組比較 *P<0.05，**P<0.01；與模型組比較# P<0.05。

2.5 免疫組化結(jié)果

陽(yáng)性細(xì)胞主要位于內(nèi)膜和內(nèi)膜下層，陽(yáng)性棕色顆粒主要位于陽(yáng)性細(xì)胞的胞核。與對(duì)照組相比，模型組動(dòng)物NFκB/p65的表達(dá)明顯升高 (P<0.01)。與模型組比較Rb1組中NFkB/p65的表達(dá)明顯降低(P<0.01)(圖5見(jiàn)彩插7、表2)。

表2 大鼠主動(dòng)脈NFκB表達(dá)的吸光度值及陽(yáng)性表達(dá)面積±s，n=6)

2.6 ELISA法測(cè)定大鼠血清TNFα、IL6結(jié)果

各組大鼠血清炎性因子TNFα、IL6水平的變化結(jié)果見(jiàn)表3，由表可見(jiàn)模型組大鼠血清中TNFα、IL6水平與對(duì)照組相比顯著升高，Rb1能抑制這兩種炎性因子的增高。

表3 大鼠血清TNFα、IL6表達(dá)水平的變化±s，n=6,pg/mL)

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性持續(xù)性炎癥反應(yīng)性疾病的觀點(diǎn)已被廣泛認(rèn)同[1,8,9]，為了能夠深入探索持續(xù)性炎癥反應(yīng)與動(dòng)脈粥樣硬化之間的關(guān)系及相關(guān)的機(jī)制等研究，建立一種穩(wěn)定的由持續(xù)性炎癥反應(yīng)促發(fā)的AS動(dòng)物模型是非常必要的。目前的AS動(dòng)物模型主要包括鼠、兔、豬及靈長(zhǎng)類動(dòng)物等[10]，其中由于良好的遺傳背景，容易飼養(yǎng)及成本低廉，應(yīng)用最廣泛的是鼠類動(dòng)物模型，尤其是基因敲除小鼠，如apoE和LDLR敲除小鼠，為研究AS的發(fā)病機(jī)制作出了突出貢獻(xiàn)[11]，但是apoE和LDLR敲除小鼠均是從機(jī)體脂代謝的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)對(duì)脂代謝過(guò)程進(jìn)行干預(yù)，與之相比，本研究中的動(dòng)物模型更充分考慮到炎癥反應(yīng)作為誘發(fā)因素在AS發(fā)病中的作用；此外相比于小鼠，大鼠的體積大小適中，標(biāo)本取材量及取材方法更適于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究；而且我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，相同情況下大鼠在各種干預(yù)措施的影響下較小鼠的生存率明顯更高，利于在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)收集更多的檢測(cè)標(biāo)本。因此，本研究采用大鼠作為模型動(dòng)物，在喂飼高脂飼料的基礎(chǔ)上給予酵母多糖A激發(fā)持續(xù)性炎癥反應(yīng)，誘發(fā)大鼠主動(dòng)脈脂紋及斑塊病變的產(chǎn)生，并且通過(guò)透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜下出現(xiàn)典型的泡沫細(xì)胞。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中進(jìn)行腹腔注射時(shí)所用的針筒和針頭必須滅菌消毒，并注意嚴(yán)格無(wú)菌操作，避免細(xì)菌性感染，否則不但嚴(yán)重干擾無(wú)菌性炎癥誘發(fā)AS的形成，甚至導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡。配制的高脂飼料最好不要一次大量配制，如果配制的量較大要注意低溫保存，避免其中的豬油成分變質(zhì)，不但影響動(dòng)物的食欲，而且會(huì)對(duì)其機(jī)體造成不必要的損害。模型制備兩到三周時(shí)是大鼠狀態(tài)較差的時(shí)期，要注意勤觀察及時(shí)剔除不健康的大鼠。此外，Rb1和酵母多糖腹腔注射最好分別安排在上、下午進(jìn)行，即可避免相互影響，又便于觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的狀態(tài)。主動(dòng)脈標(biāo)本取材時(shí)注意取主動(dòng)脈弓至髂動(dòng)脈分叉處全長(zhǎng)，并要將與外膜相連的結(jié)締組織和脂肪組織清除干凈，以免影響觀察。

酵母多糖是酵母細(xì)胞壁的提取物，包含大約73%的多糖，15%的蛋白質(zhì)，7%的脂類及無(wú)機(jī)物成分，腹腔注射Zmy能觸發(fā)多種炎性介質(zhì)的釋放，包括白介素、腫瘤壞死因子、脂質(zhì)中間代謝產(chǎn)物及環(huán)氧化酶代謝產(chǎn)物等，可以造成機(jī)體嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，Zym致腹腔過(guò)度炎癥已被廣泛用于多器官衰竭模型(MOF)的制備[12-14]。因此我們根據(jù)白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，以20 mg/kg的劑量，每隔3日腹腔注射一次，引起大鼠可控制的持續(xù)性炎癥，即保證了持續(xù)性炎癥反應(yīng)的存在，又避免動(dòng)物由于過(guò)度炎癥刺激而死亡。炎癥刺激激活的白細(xì)胞以及循環(huán)中的白細(xì)胞數(shù)量增加均可損傷血管，中性粒細(xì)胞產(chǎn)物(如氧自由基等)可以直接或間接作用于內(nèi)皮或血管壁的其他成分(如細(xì)胞膜的多醣蛋白質(zhì)復(fù)合物、基底膜)而損傷血管壁的完整性，損傷的內(nèi)皮細(xì)胞又可以促進(jìn)白細(xì)胞黏附聚集到內(nèi)皮加劇炎癥反應(yīng)，單核細(xì)胞吸附侵入時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、自身調(diào)節(jié)作用減弱也是造成內(nèi)膜損傷的關(guān)鍵性因素[14-16]。此時(shí)，在與炎癥相關(guān)因子的相互作用下，遷移的單核巨噬細(xì)胞吞噬變性脂蛋白形成泡沫細(xì)胞[17],這可能是炎癥反應(yīng)促發(fā)AS的機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在模型組動(dòng)物主動(dòng)脈壁出現(xiàn)典型的AS樣病變，同時(shí)，定量PCR和免疫組織化學(xué)染色均顯示炎癥過(guò)程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NFκB/p65表達(dá)顯著升高，包括與其密切關(guān)聯(lián)的炎癥因子TNFα、IL6，表明炎癥反應(yīng)在AS病變發(fā)生過(guò)程中的重要作用。

眾多的文獻(xiàn)報(bào)道，中藥三七總皂苷具有顯著的抗AS效應(yīng)[18]，人參皂苷Rb1是三七總皂苷中的主要成分之一，如前所述，我們?cè)诩?xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)其能有效抑制泡沫細(xì)胞的形成，因此本研究進(jìn)一步在炎癥反應(yīng)誘發(fā)的大鼠AS模型中觀察了Rb1的抗AS效應(yīng)，結(jié)果顯示Rb1能有效的抑制AS病變的進(jìn)展程度，同時(shí)顯著降低NFκB/p65及相關(guān)炎性因子TNFα、IL6的表達(dá)，表明了Rb1不但在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中能抑制泡沫細(xì)胞的形成，而且在體內(nèi)亦能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮抗AS作用。

4 結(jié)論

炎癥反應(yīng)是誘發(fā)AS的重要原因之一，在高脂喂飼的基礎(chǔ)上通過(guò)Zmy腹腔注射引發(fā)持續(xù)性炎癥可以促發(fā)大鼠主動(dòng)脈壁泡沫細(xì)胞的形成，人參皂苷Rb1在模型動(dòng)物體內(nèi)具有較好的抗AS作用。

(本文圖2,5見(jiàn)彩插7)。

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