潑尼松灌胃與肌內(nèi)注射對(duì)大鼠骨密度、骨生物力學(xué)性能及骨代謝的影響

梁德，唐晶晶，江曉兵，2，姚珍松，2，張順聰，2，楊志東，2，魏秋實(shí)，崔健超，任輝，沈耿楊，林順鑫

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣州 510405)

糖皮質(zhì)激素在結(jié)締組織病、免疫系統(tǒng)疾病、腎臟疾病、器官移植、哮喘、休克等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用, 超生理劑量的皮質(zhì)醇對(duì)骨組織的發(fā)育、生長(zhǎng)有著明顯不利的影響。20世紀(jì)30年代一些美國(guó)學(xué)者就對(duì)糖皮質(zhì)激素所致的骨質(zhì)疏松(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)有了詳細(xì)描述。GIOP[1-3]是臨床常見的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的首要原因，也是骨質(zhì)疏松的第三位原因[4]。GIOP隨著糖皮質(zhì)激素的廣泛應(yīng)用也越來越常見，因此對(duì)于 GIOP尋找有效的干預(yù)措施具有重要意義，也因此成為醫(yī)學(xué)界急待解決的課題。在維持激素用量的條件下，作者觀察了相同時(shí)間內(nèi)不同的給藥方法是否可以減少激素對(duì)骨密度、骨生物力學(xué)、骨代謝、病理形態(tài)等方面的影響，為臨床運(yùn)用激素的給藥方式提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠45只，5～7周齡，雄性，體重(200±20)g，購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心【SCXK(粵)2013-0020】。實(shí)驗(yàn)在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行【SYXK(粵)2010-0092】，飼養(yǎng)溫度(22±3)℃，濕度55%～75%，自然光節(jié)律，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 藥物與儀器

潑尼松(廠家：廣東三才石岐制藥有限公司，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H14020327)；生理鹽水(廠家：四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：N14011602-1)；雙能X線吸收骨密度儀(美國(guó)Hologic公司)等。

1.3 動(dòng)物分組與造模

將 SPF級(jí)雄性SD大鼠45只隨機(jī)分為正常組、灌胃組、肌內(nèi)注射組(n=15)，其中正常組大鼠作為陰性對(duì)照，給予生理鹽水灌胃2 mL/d，灌胃組大鼠給予潑尼松0.5 mg/(kg·d)灌胃;肌內(nèi)注射組大鼠給予潑尼松0.5 mg/ (kg·d)，連續(xù)干預(yù)12周后，將各組大鼠10%利多卡因腹腔注射麻醉處死，取大鼠血清、腰椎骨、股骨，剔除肌內(nèi)和結(jié)締組織，用生理鹽水浸泡的濕紗布包裹，-80℃密封保存，用于骨生物力學(xué)及骨BMD檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血清β-CTX、PINP水平及椎骨骨密度

取各組大鼠血清測(cè)定β-CTX、PINP水平、椎骨采用雙能X線吸收骨密度儀(美國(guó)Hologic公司)檢測(cè)各組大鼠腰4～6椎體的BMD，采用單位面積內(nèi)的骨礦物質(zhì)含量 (g/cm2)表示。結(jié)果，與正常組相比，灌胃組及肌內(nèi)注射組大鼠中血清β-CTX水平均顯著升高(P<0.05)而PINP水平均顯著降低(P<0.05)，與灌胃組相比，肌內(nèi)注射組大鼠血清β-CTX水平顯著升高(P<0.05)而PINP水平顯著降低(P<0.05)。與正常組相比，灌胃組、肌內(nèi)注射組大鼠椎骨骨密度值均明顯下降(P<0.05)；與灌胃組相比，肌內(nèi)注射組大鼠椎骨骨密度值降低(P<0.05)，見表1。

表1 血清β-CTX、PINP水平及骨密度測(cè)定結(jié)果 ± s，n =15)

2.2 生物力學(xué)指標(biāo)

采用三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)：取各組大鼠的左側(cè)股骨，解凍，作為試樣，將其置于微機(jī)控制電子萬能試驗(yàn)機(jī)支座上，跨距20 mm，加載速度1 mm/min。用游標(biāo)卡尺測(cè)量股骨中段的長(zhǎng)軸、短軸及長(zhǎng)短軸方向的壁厚，由載荷形變曲線可以得出最大載荷、斷裂載荷、彈性載荷等數(shù)值。結(jié)果，與正常組相比, 灌胃組及肌內(nèi)注射組大鼠股骨的彈性載荷、最大載荷、斷裂載荷均明顯降低(P<0.05)，肌內(nèi)注射組與灌胃組大鼠的彈性載荷、最大載荷、斷裂載荷相比差異無顯著性(P>0.05)，見表2。

表2 三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)力學(xué)參數(shù)變化 ± s)

2.3 骨組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)

(采用日本Olympus顯微鏡觀察神經(jīng)根組織的病理改變并攝影)組織切片HE染色顯示12周后，正常組大鼠骨小梁飽滿，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，骨髓細(xì)胞數(shù)量較多。灌胃組大鼠骨小梁疏松，形態(tài)結(jié)構(gòu)欠完整，造血組織減少，脂肪細(xì)胞較正常大鼠組增多。肌內(nèi)注射組大鼠的骨小梁明顯纖細(xì)疏松，形態(tài)結(jié)構(gòu)斷裂、扭曲，造血組織明顯減少，脂肪組織大量增多(見圖1，彩插14)。

3 討論

目前，糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松 (glucocorticoid-induced osteoporosis, GIOP ) 是繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的首要原因，在該疾病病因病理探討及防治上，很多國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，建立激素性骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型[5]，運(yùn)用各種藥物進(jìn)行干預(yù)，取得了一定的研究進(jìn)展。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明長(zhǎng)期服用激素導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的患病率僅次于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥,為20～40歲人群骨質(zhì)疏松癥最常見原因之一[6-7],然其具體發(fā)病機(jī)制尚不明確。部分學(xué)者認(rèn)為過量的糖皮質(zhì)激素會(huì)抑制成骨細(xì)胞前體細(xì)胞的分化和影響成熟成骨細(xì)胞的功能,促進(jìn)成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的凋亡,使骨細(xì)胞數(shù)目減少。糖皮質(zhì)激素的使用時(shí)間及總量是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的觀點(diǎn)尚存在爭(zhēng)論[8-10]，很多學(xué)者認(rèn)為長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素為誘發(fā)骨質(zhì)疏松的重要因素，然而Hall和Lane等[11-12]的研究表明,曾經(jīng)使用過糖皮質(zhì)激素的患者停用一段時(shí)間后與未使用過糖皮質(zhì)激素者BMD相同。這說明骨量的丟失是可逆的,停用糖皮質(zhì)激素后BMD會(huì)逐漸增加。目前大多數(shù)爭(zhēng)議都圍繞在糖皮質(zhì)激素的使用時(shí)間和劑量對(duì)骨密度及其他相關(guān)指標(biāo)的研究上，而對(duì)于不同途徑的給藥方式對(duì)骨密度、骨生物力學(xué)、骨代謝方面的影響的研究尚不多見。由于大多數(shù)患者因不同的急慢性疾病而需要長(zhǎng)時(shí)間服用激素,很多患者達(dá)到維持量后減藥困難,找到一種合理的激素?cái)z取方式可能會(huì)減少對(duì)骨密度、骨生物力學(xué)、骨代謝的影響，從而減少骨質(zhì)疏松的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。吳天秀[13]也通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期使用高劑量糖皮質(zhì)激素，不論是每日給藥還是隔日給藥均可以引起大鼠骨量減少，發(fā)生骨質(zhì)疏松。與此同時(shí)，骨質(zhì)疏松除了骨量減少的因素外 , 還與骨結(jié)構(gòu)因素和骨內(nèi)微損傷的數(shù)量有關(guān)，骨微損傷存在于活體骨中并影響骨組織微結(jié)構(gòu)性質(zhì)和功能。骨小梁退行性改變與顯微骨折導(dǎo)致了骨小梁結(jié)構(gòu)強(qiáng)度下降。因此骨顯微結(jié)構(gòu)的改變可以更直接地反映骨質(zhì)疏松情況。近年來，國(guó)內(nèi)外很多研究顯示骨形成標(biāo)志物I型前膠原氨基端前肽[14](procollagen type I N-propeptide，PINP)及骨吸收標(biāo)志物I型膠原羥基端肽[15](C-terminal cross-linking telopeptide of type I collagen，β-CTX)靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性均較高，是評(píng)價(jià)骨代謝的良好指標(biāo)。測(cè)定血清PINP、β-CTX的含量不僅對(duì)了解骨代謝變化,觀察成骨細(xì)胞的功能狀態(tài)和破骨細(xì)胞的活性具有重要意義,而且為骨質(zhì)疏松的診斷及治療提供了有價(jià)值的指標(biāo)。Engvall等[16]通過一項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期服用低劑量的潑尼松龍對(duì)早期內(nèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者會(huì)導(dǎo)致骨密度快速的降低，PINP、β-CTX的含量都降低，但PINP下降更明顯和快速，反映成骨能力顯著降低，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的產(chǎn)生。

本實(shí)驗(yàn)通過不同的途徑給予潑尼松，并于12 周時(shí)測(cè)定大鼠相關(guān)指標(biāo)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，無論是口服或肌內(nèi)注射潑尼松都會(huì)導(dǎo)致大鼠骨密度降低，且肌內(nèi)注射組大鼠椎骨骨密度降低最顯著。這表明肌內(nèi)注射潑尼松的給藥方法能更快的降低骨密度，從而可能更快誘發(fā)骨質(zhì)疏松。骨生物力學(xué)指標(biāo)是骨量、形態(tài)、結(jié)構(gòu)和完整程度的綜合體現(xiàn) ,能直接反映骨強(qiáng)度和抗骨折能力[17-18],已成為評(píng)價(jià)骨骼特性和抗骨質(zhì)疏松藥物療效不可缺少的指標(biāo)生物力學(xué)特性包括骨的材料特性和結(jié)構(gòu)特性兩個(gè)方面。由于結(jié)構(gòu)特性已經(jīng)可以反映骨骼抵抗外力的能力 ,所以在本實(shí)驗(yàn)中,我們只檢測(cè)骨的結(jié)構(gòu)特性指標(biāo)，運(yùn)用股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)分別測(cè)定了彈性載荷、最大載荷、斷裂載荷等指標(biāo)，研究顯示, 口服組及肌內(nèi)注射組大鼠股骨的彈性載荷、最大載荷、斷裂載荷均明顯低于正常組，肌內(nèi)注射組大鼠的彈性載荷、最大載荷、斷裂載荷等指標(biāo)與口服組相比無顯著差異。這表明由于激素的運(yùn)用使得骨表面骨吸收活動(dòng)的增強(qiáng)，造成松質(zhì)骨骨量減少，尤其是造成骨結(jié)構(gòu)破壞是導(dǎo)致GIOP大鼠松質(zhì)骨骨強(qiáng)度明顯下降。此外，在本次研究中發(fā)現(xiàn)血清PINP水平明顯降低、β-CTX的含量升高，且都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這與部分學(xué)者報(bào)道有所差異，這可能是由于早期激素的使用導(dǎo)致了一個(gè)高轉(zhuǎn)換的骨代謝狀態(tài)，成骨和破骨的穩(wěn)態(tài)失衡所致。由此可見，肌內(nèi)注射潑尼松可能會(huì)更快破壞骨穩(wěn)態(tài)和骨細(xì)微結(jié)構(gòu)，更快導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的產(chǎn)生，本次實(shí)驗(yàn)的病理組織切片觀察也顯示口服組與肌內(nèi)注射組大鼠的骨小梁纖細(xì)疏松，造血組織減少，脂肪組織增多，且肌內(nèi)注射組表現(xiàn)更明顯，從而進(jìn)一步印證了這一論點(diǎn)。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明激素的運(yùn)用會(huì)影響大鼠骨密度、骨生物力學(xué)及骨代謝的變化，且不同的激素給藥方式所造成的影響存在一定的差異性。肌內(nèi)注射潑尼松會(huì)更快的減低骨密度、降低骨強(qiáng)度，破壞骨細(xì)微結(jié)構(gòu)，從而更早期的誘發(fā)骨質(zhì)疏松，由此可為臨床上一些不得不長(zhǎng)期或短期使用激素的患者在用藥方式的選擇上提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，以期更好的達(dá)到預(yù)防骨質(zhì)疏松并發(fā)癥的目的。

(本文圖1見彩插14)。

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