大豆蛋白中7S與11S組分的分離方法

張明成

（綏化學(xué)院 黑龍江綏化 152061）

一、前言

大豆中含有大量的貯存蛋白質(zhì)，其含量可高達(dá)40%。根據(jù)沉降系數(shù)的不同，大豆蛋白可分為2 S、7 S、11 S和15 S四種組分，其中，7 S組分中的β-伴大豆球蛋白（β-c o n g l y c i n i n）和11 S組分中的大豆球蛋白（g l y c i n i n）是大豆分離蛋白的主要成分。由于7 S和11 S氨基酸的組成、亞基的結(jié)構(gòu)及其相互作用不同，他們表現(xiàn)出的功能性質(zhì)如乳化性、凝膠型等存在較大差異，與11 S球蛋白相比，β-伴大豆球蛋白蛋白含有的巰基和二硫鍵較少，導(dǎo)致其凝膠保水性和黏結(jié)性較差，而含有的賴氨酸和疏水性氨基酸較多導(dǎo)致其具有較強(qiáng)的表面活性、較好的溶解性、乳化性與穩(wěn)定性[1][2]。段春紅[3]等研究大豆分離蛋白亞基及7 S/11 S比例對(duì)肉腸品質(zhì)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)7 S/11 S與肉腸的彈性呈現(xiàn)極顯著的正相關(guān)性，與咀嚼性和凝膠強(qiáng)度均呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性，但與硬度的相關(guān)性不顯著，與得率呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)性。

20世紀(jì)50年代起至今，人們一直不斷研究7 S與11 S的分離方法，這些方法主要包括堿溶酸提法、冷沉法、鹽析法等，其中堿溶酸提法由于其較好的得率和提純純度一直被視為經(jīng)典的分離方法，但近來也有學(xué)者在冷沉的基礎(chǔ)上研究?jī)鋈谔幚淼姆蛛x方法。

二、超速離心分離法

超速離心根據(jù)沉降系數(shù)劃分大豆蛋白質(zhì)組分，是一種非常直接的方法。Wo l f等人[4][5]用超速離心技術(shù)分析了大豆種子提取蛋白，計(jì)算了沉降系數(shù)S,根據(jù)超速離心的光吸收曲線峰谷變化所對(duì)應(yīng)的沉降系數(shù)，把大豆蛋白質(zhì)劃分為4個(gè)組分，即2 S、7 S、11 S和15 S。由于11 S與7 S分子大小不同，沉降速率存在差異，采用超速離心機(jī)可以將他們從溶液中沉淀分離出來。但是，超速離心分離心法對(duì)于大規(guī)模分離純化并不是經(jīng)濟(jì)高效的方法，僅僅適用于實(shí)驗(yàn)室對(duì)7 S或11 S組分進(jìn)行分析。

三、堿溶酸提分離法

堿溶酸提法利用蛋白質(zhì)組分間在不同溶液中等電點(diǎn)不同，通過調(diào)節(jié)p H值，使蛋白質(zhì)組分逐一沉淀，從而獲取相應(yīng)的提取物。

（一）Thanh 分離法

T h a n h等人[6]基于7 S和11 S在P H值6.1~6.6的溶解度不同研究了一種直接分離7 S和11 S的方法。大量研究表明，11 S球蛋白在P H 6.5中是可溶的，但是在T r i s-H C l緩沖液中，當(dāng)P H值6.1~6.6時(shí)，11 S表現(xiàn)得溶解性下降。T h a n h等人使用含有10 m M2-巰基乙醇T r i s緩沖液（P H 8.0）提取蛋白質(zhì)，加入了離子強(qiáng)度小于0.07的N a C l，利用“鹽溶”的效果增加了11 S組分的得率。在提取過程中添加還原劑如2-M E或S B S目的是穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)體系，保持蛋白質(zhì)自然狀態(tài)，破壞組分之間的二硫鍵從而進(jìn)一步增加獲取組分的純度。調(diào)整P H值至6.4，收集沉淀,并在2~5℃離心分離大豆球蛋白，調(diào)整P H4.8，7 S沉淀，然后再溶解到0.03 MT r i s緩沖液中，調(diào)P H值至6.2，離心后，除去不溶解的聚合物后獲得7 S組分。這種方法可以同時(shí)獲取兩種蛋白組分，但是，由于離子強(qiáng)度的不同，一部分7 S類似物會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)，蛋白質(zhì)交叉污染始終是存在的問題。11 S分離組分純度，如果提高組分的純度，需要進(jìn)一步處理，如凝膠過濾或?qū)游觯珪?huì)增加成本，而且難以規(guī)?；a(chǎn)。

（二）Nagano 分離法

為了減少中間組分的交叉污染，獲得純度高的分離組分，N a g a n o等人[7]改進(jìn)T h a n h等人的方法：1.提取液采用P H 7.5的水取代T r i s緩沖液；2.亞硫酸氫鈉作為還原劑代替具有毒性的巰基乙醇；3.調(diào)整三次 P H值（P H 6.4,P H 5.0，P H 4.8）分別得到三種蛋白質(zhì)組分沉淀，去除中間組分，沉淀中間產(chǎn)物的目的是在獲取富含大豆球蛋白的成分后，將上清液中的大豆球蛋白組分盡量沉淀，以獲得更高純度的β-伴大豆球蛋白，中間組分的蛋白質(zhì)得率和固體含量隨著N a C l含量的增加而降低。這種方法得到的兩種蛋白質(zhì)粗組分的純度大于90%。4.加入了N a C l，利用“鹽析”作用，破壞蛋白質(zhì)親水層，促進(jìn)7 S沉淀。這一方法大大提高了提取組分的純度，但是7 S與11 S組分的得率大大降低。朱曉燁等[8]對(duì)N a g a n o法的條件進(jìn)行了優(yōu)化，浸提液p H 9.0，浸提溫度選擇45℃而不是室溫，采用兩次浸提法，添加還原劑N a H S O3的量增加為0.01 m o l/L。在分離過程中，p H 5.4時(shí)除去中間組分，優(yōu)化后的方法其提取率和蛋白純度與N a g a n o法相比得到提高。

（三）Wu 的分離方法

1999年，Wu等人[9]不僅將僅限于實(shí)驗(yàn)室獲取蛋白組分的N a g a n o的方法進(jìn)行改進(jìn)，而且研究了一種適合中試規(guī)模生產(chǎn)的提取方法，將分離各步驟中采用的離心速度進(jìn)行修改，并使用兩步提取代替一步提取，從而提高了產(chǎn)物得率和純度。但是，中試過程沒有使用實(shí)驗(yàn)室操作的方法操作中的膜過濾脫鹽步驟。它所獲得的大豆球蛋白和中間混合組分的得率低于實(shí)驗(yàn)室操作的方法，這可能是由于離心機(jī)不同而在離心過程中造成了損失。11 S純度在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模和中試規(guī)模條件下分別為95.7%和84.2%，7 S分別為77.6和71.8%。

（四）Liu 等人的分離方法

基于N a g a o和T h a n h方法，L i u等人[10]優(yōu)化了從提取液中分離蛋白的方法，P H調(diào)整至8.5、溫度從上述方法采用的室溫提升至45℃、大豆粉/T r i s-H C l緩沖液的比率以及N a H S O3的濃度均做了調(diào)整，最終獲取的富含7 S和11 S組分的得率分別達(dá)到了14.4%和10.7%，與此同時(shí)，7 S純度也超過95.5%。司曉霞等人[11]對(duì)L i u等所報(bào)道方法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行了進(jìn)一步的條件優(yōu)化，將S B S的最適濃度確定為0.03 m m o l·L-1；二是在7 S析出之前，通過加水析出、離心法去除一次混雜的11 S球蛋白，這兩個(gè)環(huán)節(jié)的條件優(yōu)化最終使得β-伴大豆球蛋白的提取純度達(dá)到98%。

四、冷沉法分離

大豆蛋白中7 S球蛋白的含硫氨基酸含量較低，其中β-伴大豆球蛋白的β亞基無含硫氨基酸[6],11 S球蛋白含硫氨基酸含量較高，是7 S球蛋白含硫氨基酸含量的5~6倍，每摩爾11 S球蛋白分子中至少包含20個(gè)二硫鍵[12]。E.J.N o h[13]等人發(fā)現(xiàn)冷凍處理的大豆疏水作用加強(qiáng)，分子內(nèi)二硫鍵連接，不論加熱與否，冷凍處理增加了大豆蛋白的疏水性。通過冷凍處理會(huì)使二硫鍵交聯(lián)，疏水性增強(qiáng)，從而形成分子聚合物沉淀，在一定程度上實(shí)現(xiàn)11 S與其他組分如7 S的分離。Wo l f等[2]在室溫下用離心的方法提取大豆水溶性蛋白，將提取的蛋白質(zhì)水溶液進(jìn)行冰浴、離心，獲得含11 S的冷沉蛋白達(dá)到82%，這就是早期分離提取11 S組分的基本方法，稱為冷沉法(c o o l i n g p r e c i p i t a t i o n)。1967年Wo l f等[4]進(jìn)一步優(yōu)化“冷沉法”分離提取11 S的條件，通過改進(jìn)，11 S組分的含量提高至88%。

K a z u h i r o M o r i t a[14]等人研究了豆?jié){中的7 S和11 S球蛋白的凍融分餾機(jī)制，采用冷凍、緩凍的方式處理制備的豆?jié){，冷凍時(shí)，蛋白質(zhì)和復(fù)合物被冰晶包圍，在未凍結(jié)的部分中被濃縮，蛋白質(zhì)分子通過二硫鍵和/或疏水相互作用進(jìn)一步加強(qiáng)，形成主要由11 S球蛋白和11 S球蛋白-脂質(zhì)復(fù)合物組成的聚合物。在解凍階段，聚集體解凍、沉淀，7 S球蛋白由于其高親水性可能會(huì)形成可溶性聚集體保留在上清液中。因此，大多數(shù)的11 S球蛋白遷移到下層，并且大部分的7 S球蛋白的保留在解凍豆?jié){的上層。并且發(fā)現(xiàn)每當(dāng)11 S/7 S比達(dá)到或超過0.53，就形成沉淀物，即如果在豆?jié){中球蛋白11 S/7 S比值超過0.53，7 S和11 S球蛋白可以由凍融操作分離。

五、鹽析法分離

（一）Saio等人的分離方法

蛋白質(zhì)與鹽離子的作用一方面可以使蛋白質(zhì)在水中的溶解度增加，另一方面也可因?yàn)槠帘瘟似浔砻骐姾墒蛊浒l(fā)生聚沉。S a i o法的原理是基于11 S和7 S球蛋白在鈣鹽溶液中溶解度存在著較大的差異而進(jìn)行提取分離。脫脂大豆粉采用C a C l2溶液浸提,然后離心，取沉淀物置于40℃水中,調(diào)p H至8~8.2，攪拌2 h,再離心，沉淀物為11 S球蛋白粗提物，第一步中分離的上清液通過調(diào)P H值4.5得到沉淀物為7 S組分。但是，這種分離方法獲得的11 S和7 S純度較低（分別為40.4%和60.5%）[16]。

（二）Deak等人的分離方法

由于11 S與7 S表面電荷密度存在差異，7 S和11 S在同一種鹽的作用下，發(fā)生鹽析時(shí)所需鹽的濃度是不同的。D e a k等人使用C a C l2作為沉淀劑，11 S組分在P H 6.4時(shí)較7 S組分優(yōu)先與二價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合，這種改進(jìn)后的方法顯著增加了7 S和11 S組分的得率(分別為15.1和23.6%)，但是純度比N a g a n o法低[17]。與此同時(shí)，C a2+在p H 6.4時(shí)也容易與帶負(fù)電荷的植酸（P A）形成不溶性的質(zhì)酸鹽，從而導(dǎo)致植酸（P A）含量的提高[18]，并且當(dāng)p H高于4.5也易形成P A-C a2+蛋白質(zhì)復(fù)合物沉淀，破壞食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，T e n g等人[19]使用M g C l2代替C a C l2降低了11 S組分的植酸含量，同時(shí)得到令人滿意的得率（22%的11 S和16%的7 S）與純度(88%的11 S和80%的7 S)。

六、結(jié)語

綜上所述，堿溶酸提法作為一種經(jīng)典有效的分離方法廣為應(yīng)用，方法也被不斷改進(jìn)和優(yōu)化，提取的效果與提取液的溫度、種類、還原劑的種類和濃度、提取組分的P H值、離子強(qiáng)度以及離心速度有密切的聯(lián)系。冷沉法雖然研究較早但是由于提取率和純度不及堿溶酸提法而應(yīng)用較少，近來，凍融法分離也為分離方法提供了新的思路，如將可以提高提取效果的上述影響因素結(jié)合到該方法中，可能會(huì)增強(qiáng)冷沉法的提取效果。

[1]Tsubokura Y，Hajika M，Harada K.Molecular characterization of aβ-Conglycinin deficient soybean[J].Euphytica，2006.

[2]姜振峰等.大豆種質(zhì)資源貯藏蛋白亞基研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006(5).

[3]段春紅，婉思軼.大豆分離蛋白亞基及7S/11S比例對(duì)肉腸品質(zhì)的影響[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2010(1).

[4]Wolf W J,BriggsD R.Purification and characterization of the 11S component of soybean proteins[J].Arch Bioch Biophy,1959.

[5]Wolf W J,Eldridge A C,Babcock G E.Physical properties of alcohol extracted soybean proteins[J].Cereal Chem,1963.

[6]Thanh V H,Okubo K,Shibasaki K.Major proteins of soybeanseeds a straightforward fraction and their characterization heterogeneity of Betaconglycinin[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1976.

[7]NaganoT,MtohikoH,HiroyukiM,etalDynamic viscoelastic study on the gelation of7S globulin from soybeans[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1992.

[8]朱曉燁等.大豆蛋白7S和11S組分分離方法的優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技,2011(7).

[9]Wu S,Murphy P A,Lawrence A.J et al Pilot-plant fractionation of soybean glycinin and βconglycinin[J].Journal of the Amer-I can Oil Chemists'Society,1999.

[10]Chun Liu,HonglingWang,Zhuimei Cu,i et a.l Optimization of extraction and isolation for 11S and 7S glibulins of soybean seed storage protein[J].Food Chemistry,2007.

[11]司曉霞等.大豆中β-伴大豆球蛋白提純方法的優(yōu)化[J].植物研究,2011(4).

[12]Chandrika L P，F(xiàn)ereidoon S.Optimization of extraction of phenolic compounds from wheat using response surfaceme thodology[J].Food Chemistry,2005.

[13]E.J.Noh a,S.Y.Parkb,J.I.Pakc,S.T.Hongd,S.E.Yuna.Coagulation of soymilk and quality of tofu as affected by freeze treatment of soybeans[J].Food Chemistry,2005.

[14]Kazuhiro Morita,Makoto Shimoyamada.Proposal of mechanism of the freeze thaw fractionation of 7S and 11S globulins in soymilks[J].Food Chemistry,2013.

[15]Kyokok Saio,Twao Sato,Tokuji Watanabe.Food use of soybean 7S and 11S proteins High temperature expansion characteristics of gels[J].Food science,1974.

[16]王孝英等.7S和11S大豆球蛋白的分離研究[J].中國(guó)食品添加劑，2006（3）.

[17]DeakNA,MurphyPA,JohnsonLA.Effectsof reducing agent concentration on soy protein fractionation and functionality[J].Journal of Food Science,2006.

[18]GrynspanF,Cheryan M.Calcium Phytate:effct of PH and molar ratio on invitro solubility[J].Am Oil Chem Soc,1983.

[19]Zi Teng.Chong Liu.Xiao quan Yang.Lin Li.Chuan he Tang.Yue ming Jiang.Fractionation of Sogbean Globulins Using Ca2+and Mg2+:A Compara tive Anglysis[J].Am Oil Chem Soc,2009.