依達(dá)拉奉對(duì)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞水通透性的影響

李 穎，趙興敏

0 引言

心臟驟停(Cardiac arrest,CA)后腦損害既是心肺復(fù)蘇(Cardiopulmonary resuscitation,CPR)后的表現(xiàn)[1]，也是導(dǎo)致病情加重直至死亡的主要原因之一[2]。大多數(shù)幸存者復(fù)蘇后表現(xiàn)為昏迷和意識(shí)障礙并最終出現(xiàn)慢性傷殘[3]。水通道蛋白家族(Aquaporins，AQPs)是一組與水電解質(zhì)運(yùn)輸平衡密切相關(guān)的選擇性細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。星形膠質(zhì)細(xì)胞是大腦主要的細(xì)胞，心臟驟停復(fù)蘇后會(huì)出現(xiàn)水腫。本研究通過構(gòu)建缺氧復(fù)氧模型，觀察依達(dá)拉奉對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞模型水通透性和水通道蛋白4(AQP4)的影響，以探討依達(dá)拉奉是否在心臟驟停復(fù)蘇后的水腫中具有抑制作用。

1 材料與方法

1.1 大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng) 新生1～2 d Wistar大鼠乳鼠，經(jīng)75%酒精消毒，斷頭處死，取腦放入冷的D-Hanks平衡鹽溶液，去除腦膜及大血管。分離兩側(cè)大腦皮質(zhì)并剪成1 mm3大小，加入0.25%胰蛋白酶37 ℃空氣浴震蕩消化10 min，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，1 000 rpm離心 10 min，去上清，再用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸沉淀。經(jīng)75 m篩網(wǎng)過濾，收集濾液，1 000 rpm離心 10 min，收集沉淀用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至1.5×106/mL，種植于75 cm2培養(yǎng)瓶，經(jīng)1 h差速黏附去除成纖維細(xì)胞后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到一新的75 cm2培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，2 d換液1次。7 d后將培養(yǎng)瓶放入水平搖床，37 ℃,260 rpm 2 h，換液棄除小膠質(zhì)細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱平衡1 h，重新置于水平搖床，37 ℃，260 rpm 18 h，換液棄除少突膠質(zhì)細(xì)胞，用新鮮培養(yǎng)基洗2遍，加入0.25%胰蛋白酶與0.02%EDTA 1∶1混合液消化、傳代備用。采用GFAP兔抗大鼠多克隆抗體進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞純度鑒定(GFAP陽(yáng)性率達(dá)95%以上)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 將GFAP陽(yáng)性率為95%以上細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，用新鮮DMEM稀釋至1×104細(xì)胞/mL濃度。將細(xì)胞懸液分裝至96孔板內(nèi)，并將平板放于5%CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)至平板底部60%有細(xì)胞為止。更換新鮮的10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，置37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù)) CO2、95%(體積分?jǐn)?shù)) N2的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行缺氧培養(yǎng)8 h，8 h后即刻將接入95%(體積分?jǐn)?shù))N2的接口斷開，重新接入95%(體積分?jǐn)?shù))的空氣進(jìn)行復(fù)氧培養(yǎng)9 h。將96孔板分成如下各組：空白組：細(xì)胞直接培養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；對(duì)照組：細(xì)胞直接培養(yǎng)，直接進(jìn)行缺氧和復(fù)氧操作；刺激組：在缺氧處理前，向細(xì)胞中加入依達(dá)拉奉至終濃度為0.1、1、10、100 μg/mL，然后進(jìn)行缺氧和復(fù)氧操作。

1.3 細(xì)胞水通透性檢測(cè) 取出不同時(shí)間(通氧前、缺氧8 h、通氧3 h、通氧6 h和通氧9 h)各組3個(gè)孔的細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞對(duì)[3H]water (200 mCi/mL,Sigma)的通透性(Pd),結(jié)果以cm/sec表示。

1.4 Real time PCR 取出不同時(shí)間(通氧前、缺氧8 h、通氧3 h、通氧6 h和通氧9 h)各組3個(gè)孔的細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，用PBS洗脫，400×g或1 700 rpm離心5 min，去上清，收集細(xì)胞。使用TRIzol Reagent試劑盒抽提細(xì)胞的總mRNA,并用DEPC水定量至5 μg/μL。使用PrimeScript One Step RT-PCR Kit將總mRNA擬轉(zhuǎn)錄成cDNA，并定量。特異性引物為：GAPDH-F:5′-TGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3′,GAPDH-R:5′-GCTCCGGAAGATGGTGATGG-3′;AQP4F:5′-TGGTTCAGTGCTTCGGCCAC-3′;AQ-P4R5′-CCAGCAGTGAGGTTTCCATG-3′,均為上海生工合成。以GAPDH為內(nèi)參，使用SYBR Green熒光定量PCR試劑盒和伯樂的IQ5 PCR系統(tǒng)擴(kuò)增cDNA中的組織因子基因片段和GAPDH基因片段，反應(yīng)條件設(shè)置為：95 ℃變性5 min，94 ℃變性30 s,57 ℃退火1 min,72 ℃延伸30 s,30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。計(jì)算每個(gè)樣品TF和GAPDH的△Ct，并采用△△Ct法計(jì)算每個(gè)樣品中TF的mRNA轉(zhuǎn)錄倍數(shù)[14]。

1.5 Western Blot 取出不同時(shí)間(通氧前、缺氧8 h、通氧3 h、通氧6 h和通氧9 h)各組3個(gè)孔的細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，用PBS洗脫，400×g或1 700 rpm離心5 min，去上清，用緩沖溶液[50 mM Tris-HCl,pH 7.4,150 mM NaCl,1%Nonidet P-40,0.5%deoxycholic acid,0.1%sodium dodecyl sulfate(SDS),5 mM ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA),2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF),20 μg/mL aprotinin,20 μg/mL leupeptin,10 μg/mL pepstanin A,and 150 mM benzamidine]重懸細(xì)胞至5×1010個(gè)。破碎后12 000 rpm離心20 min后取上清進(jìn)行電泳。使用5%濃縮膠和15%分離膠進(jìn)行電泳分離，并使用電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。10%牛奶封閉PVDF膜1 h，37度孵育一抗1 h，然后PBST清洗3次，每次5 min，然后用37度孵育二抗稀釋液，并用PBST清洗3次，每次5 min。最后用ECL+plusTM Western blotting system kit (Amersham,USA)配置顯光液，使用3490 photo gel imaging systems (Epson,Japan)拍照并記錄，并用Image Pro PLUS軟件分析每個(gè)蛋白與GAPDH的相對(duì)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有計(jì)量資料比較均采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧和復(fù)氧過程中星形膠質(zhì)細(xì)胞水通透性和AQP4表達(dá) 對(duì)原代培養(yǎng)的細(xì)胞缺氧8 h處理，然后復(fù)氧12 h，檢測(cè)缺氧復(fù)氧過程中0 h、8 h、復(fù)氧后4 h、復(fù)氧后6 h和復(fù)氧后8 h星形膠質(zhì)細(xì)胞水通透性和AQP4表達(dá)情況，結(jié)果見圖1～圖3。結(jié)果顯示，缺氧階段對(duì)照組和空白組水通透性、AQP4 mRNA和蛋白表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，復(fù)氧6 h和8 h時(shí)對(duì)照組水通透性、AQP4 mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著高于空白組。說(shuō)明缺氧8 h和復(fù)氧6 h或8 h均可構(gòu)建出星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫模型，且細(xì)胞水腫后AQP4表達(dá)量會(huì)上升。選擇缺氧8 h和復(fù)氧6 h作為復(fù)氧模型構(gòu)建方法。

圖1 缺氧和復(fù)氧過程中星形膠質(zhì)細(xì)胞水通透性變化情況

圖2 缺氧和復(fù)氧過程中星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4 mRNA表達(dá)情況

圖3 缺氧和復(fù)氧過程中星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4蛋白表達(dá)情況

2.2 依達(dá)拉奉對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞水通透性和AQP4表達(dá)的影響 取缺氧8 h和復(fù)氧6 h的星形膠質(zhì)細(xì)胞作為缺氧復(fù)氧模型的構(gòu)建方法。按照“1.2”中的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激，在復(fù)氧6 h時(shí)檢測(cè)各組細(xì)胞水通量、AQP4 mRNA水平和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果見圖4～圖6。0.1 μg/mL依達(dá)拉奉刺激后，細(xì)胞水通量、AQP4 mRNA水平和蛋白表達(dá)量與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),1、10或100 μg/mL依達(dá)拉奉刺激后，細(xì)胞水通量、AQP4 mRNA水平和蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P均<0.05),與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

圖4 不同濃度依達(dá)拉奉刺激后星形膠質(zhì)細(xì)胞水通量變化情況

圖5 不同濃度依達(dá)拉奉刺激后星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4 mRNA水平變化情況

圖6 不同濃度依達(dá)拉奉刺激后星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4蛋白變化情況

3 討論

本文探討依達(dá)拉奉對(duì)缺氧和復(fù)氧后的星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4表達(dá)以及細(xì)胞水腫的影響，結(jié)果如下：(1)缺氧8 h和復(fù)氧6 h或8 h可顯著增加星形膠質(zhì)細(xì)胞水通量以及細(xì)胞內(nèi)AQP4 mRNA水平和蛋白表達(dá)，引起細(xì)胞水腫；(2)0.1 μg/mL依達(dá)拉奉刺激無(wú)法顯著改變細(xì)胞水腫情況；(3)1、10或100 μg/mL依達(dá)拉奉刺激后,細(xì)胞水通量、AQP4 mRNA水平和蛋白表達(dá)量均顯著下降。上述結(jié)果說(shuō)明，1、10或100 μg/mL依達(dá)拉奉可通過抑制AQP4 mRNA水平和蛋白表達(dá)來(lái)達(dá)到顯著抑制細(xì)胞水腫的效果。

依達(dá)拉奉是一種可以清除腦部自由基的藥物，用于治療腦梗死引起的神經(jīng)病變[4-5]。大鼠實(shí)驗(yàn)顯示，在缺血/缺氧再灌注后靜脈給予依達(dá)拉奉，可阻止腦水腫和腦梗死的進(jìn)展，并緩解所伴隨的神經(jīng)癥狀，抑制遲發(fā)性神經(jīng)元死亡[6]。臨床研究顯示，依達(dá)拉奉可清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，從而抑制腦細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷[6-7]。另外，大量的研究表明，腦梗死過程中會(huì)伴隨腦水腫，主要表現(xiàn)為膠質(zhì)細(xì)胞的水腫。膠質(zhì)細(xì)胞水腫是一種常見的腦部損傷后再?gòu)?fù)蘇的癥狀，是在腦部劇烈損傷后表現(xiàn)的一種腦部損傷。臨床研究表明，藥物可以抑制膠質(zhì)細(xì)胞水腫，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)神經(jīng)病變的作用[8]。內(nèi)源性H2S抑制腦水腫是常見的臨床現(xiàn)象，藥物刺激也會(huì)抑制[9]。因此，依達(dá)拉奉很可能也會(huì)表現(xiàn)為抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫的臨床效果。本文的結(jié)果顯示，1、10或100 μg/mL依達(dá)拉奉會(huì)抑制AQP4 mRNA水平和蛋白表達(dá)，從而達(dá)到顯著抑制細(xì)胞水腫的效果。黃亮等[10]評(píng)價(jià)了依達(dá)拉奉干預(yù)后大鼠心肺復(fù)蘇后腦AQP4表達(dá)與腦水腫動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果得出，心肺復(fù)蘇后大腦水腫的同時(shí)，組織AQP4 mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著升高，但依達(dá)拉奉干預(yù)后大鼠腦水腫減輕，且AQP4表達(dá)量均下降，說(shuō)明依達(dá)拉奉可通過降低腦組織內(nèi)AQP4的表達(dá)量來(lái)達(dá)到減輕腦水腫的作用。尹澤黎等[11]發(fā)現(xiàn)，依達(dá)拉奉可通過清除自由基而發(fā)揮抑制腦水腫的作用。并且在臨床上，依達(dá)拉奉聯(lián)合血塞通注射液治療可明顯減輕腦水腫[12]。屈家虎等[13]使用亞低溫聯(lián)合依達(dá)拉奉也可使顱腦外傷后腦水腫減輕。張衍等[14]進(jìn)一步闡述了依達(dá)拉奉抑制水腫的分子機(jī)制，明確了AQP4被抑制后細(xì)胞水腫也被抑制。本研究發(fā)現(xiàn)，依達(dá)拉奉可直接作用大腦主要的神經(jīng)細(xì)胞星形膠質(zhì)細(xì)胞，且與上述腦水腫類似的是，依達(dá)拉奉通過抑制AQP4表達(dá)，發(fā)揮抑制神經(jīng)細(xì)胞星形膠質(zhì)細(xì)胞的水腫。

本研究觀察到依達(dá)拉奉對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的水腫具有抑制作用，但尚未證明依達(dá)拉奉是通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫來(lái)抑制腦部水腫，如需證明這一結(jié)論，需要在腦部組織檢測(cè)組織內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4表達(dá)以及水腫情況。另外，由于本文是直接藥物刺激，機(jī)體內(nèi)依達(dá)拉奉是否直接刺激細(xì)胞或者通過相關(guān)途徑發(fā)揮作用，還需要進(jìn)一步去研究分析。

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