活血定痛合劑中丹參素和原兒茶醛的含量測定

李全斌，張昌文，吳建萍，錢洪波，李紀元

0 引言

活血定痛合劑(HXDTM)為醫(yī)院協(xié)定處方制備的中藥復(fù)方醫(yī)院制劑，由丹參、赤芍、當歸、川芎、紅花、生地、桃仁、蘇木、陳皮、枳殼、瓜蔞等十多味中藥制成，前期藥理學(xué)實驗初步證實了HXDTM具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛及改善微循環(huán)作用[1-5]。該制劑中諸藥合用,可主治因氣滯血瘀之痛癥、跌打損傷、骨折腫痛等，具有活血化瘀、消腫止痛之功效，療效確切。丹參作為我國傳統(tǒng)的中藥材之一，其有效成分復(fù)雜，組方中丹參的水溶性酚酸類化合物(均具有鄰二酚羥基苯甲醛的結(jié)構(gòu))，如丹參素、原兒茶醛和丹酚酸B等，以及脂溶性的二萜醌類化合物，如丹參酮Ⅰ、二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮等，在丹參的生物學(xué)活性方面占有重要的地位，因此，可用于丹參制劑的質(zhì)量控制與評價[6]。

活血定痛合劑采用水提工藝制備，用薄層色譜對HXDTM中的當歸、川芎、紅花、赤芍、丹參等進行定性鑒別，通過在室溫下留樣試驗考察該制劑的外觀、性狀、鑒別以及微生物限度等項目，表明該制劑質(zhì)量穩(wěn)定[7]。但該制劑中脂溶性成分丹參酮ⅡA含量很低，難以檢測，為了進一步有效地控制活血定痛合劑的質(zhì)量，確保臨床用藥安全、有效，本實驗以丹參中的水溶性活性成分丹參素鈉和原兒茶醛作為含量測定的考察指標，用高效液相色譜法測定活血定痛合劑中二者含量，方法簡便準確，結(jié)果滿意，為控制活血定痛合劑的質(zhì)量提供了可靠實驗依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilentl100高效液相色譜儀(美國安捷倫)，Agilent紫外檢測器，Agilent色譜化學(xué)工作站，Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，XS-104微量分析天平(瑞士梅特勒公司)，摩爾純水機，UV-2201(日本島津)，Sartorius CP225D分析天平(德國Sartorius公司)。

1.2 試藥 丹參素鈉和原兒茶醛對照品(中國藥品生物制品檢定所，含量測定用，批號：110855-200507、l10810-200506)，HXDTM及陰性對照品(自制，由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬荊州醫(yī)院制劑室提供處方，規(guī)格:500 mL/瓶，批號：20120628、20120816和20121012)，甲醇(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，冰醋酸(分析純，北京化工廠)，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Agilent公司；流動相:乙腈-0.5%冰醋酸(25∶75)；柱溫:35 ℃；檢測波長:280 nm流速:1.0 mL/min；進樣量:10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品儲備液的制備 精密稱取丹參素鈉(經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h)對照品8.4 mg，置于25 mL量瓶中，用0.5%冰醋酸水溶液溶解并定容至刻度，制成質(zhì)量濃度為0.336 g/L的丹參素鈉對照品儲備溶液。

精密稱取原兒茶醛(經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h)對照品3.2 mg，置于25 mL量瓶中，用0.5%冰醋酸水溶液溶解并定容至刻度，制成質(zhì)量濃度為0.128 g/L的原兒茶醛對照品儲備溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取HXDTM 1 mL，置于10 mL量瓶中，用0.5%冰醋酸水溶液稀釋至刻度，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按HXDTM的處方及制備工藝制備不含丹參藥材的陰性樣品，按“2.2.1”項下方法制備，即得陰性對照溶液。

2.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.1”項下質(zhì)量濃度為0.336 g/L丹參素鈉對照品儲備溶液5 mL和質(zhì)量濃度為0.128 g/L的原兒茶醛對照品儲備溶液5 mL，置于10 mL的棕色量瓶中，制得含丹參素鈉168.00 μg/mL和原兒茶醛的質(zhì)量濃度為64.00 μg/mL的混合溶液，取上述混合溶液5、2.5 mL置于10 mL的棕色量瓶中，用0.5%醋酸水溶液定容稀釋，可以制得含丹參素鈉42.00、84.00 μg/mL和原兒茶醛的質(zhì)量濃度為16.00、32.00 μg/mL的混合溶液，如此操作可以制得含丹參素鈉5.25、10.50、21.00 μg/mL和原兒茶醛的質(zhì)量濃度為2.00、4.00、8.00 μg/mL的系列混合溶液，在上述色譜條件下操作，進樣量為10 μL，以丹參素鈉、原兒茶醛峰面積(A)為縱坐標，以丹參素鈉、原兒茶醛質(zhì)量濃度(C)為橫坐標，繪制標準曲線，丹參素鈉與原兒茶醛的回歸方程分別為：A1=3.915×104C1-6.912×102，r=0.998 9；A2=5.453×105C2-6.569×103，r=0.999 3。

結(jié)果表明：丹參素鈉與原兒茶醛進樣量分別在5.25～168.00 μg/mL和2.00～64.00 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 按上述色譜條件下，取線性關(guān)系項下制備的混合對照品標準溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液，設(shè)定進樣次序。記錄HPLC圖，在以上色譜條件下，丹參素和原兒茶醛與其他色譜峰能達到較好的分離，丹參素鈉保留時間約8.9 min，原兒茶醛保留時間為15.9 min；理論塔板數(shù)按丹參素計算不低于4 000，按原兒茶醛計算不低于5 000；陰性對照品溶液在丹參素和原兒茶醛吸收峰的位置上均無吸收峰，供試品溶液中丹參素鈉、原兒茶醛可達到基線分離，峰形對稱，陰性對照品溶液無干擾，基線穩(wěn)定，方法可行。實驗結(jié)果見圖1。

2.5 精密度試驗 取線性關(guān)系項下的同一混合對照品溶液(含丹參素鈉42.00 μg/mL，原兒茶醛16.00 μg/mL)10μL，在擬定的色譜條件下重復(fù)進樣6次，記錄峰面積，計算得丹參素鈉和原兒茶醛的RSD(n=6)分別為1.06%和1.09%，結(jié)果表明該儀器精密度良好。

2.6 重現(xiàn)性試驗 取HXDTM(批號：20110216)適量，按“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，在上述色譜條件下，重復(fù)進樣5次，記錄丹參素鈉和原兒茶醛的峰面積，計算得到RSD分別為0.92%和0.87%，結(jié)果表明該測定方法的重現(xiàn)性符合要求。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取HXDTM(批號：20110216)適量，室溫放置，按上述色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣分析，測定峰面積，丹參素鈉和原兒茶醛的RSD(n=6)分別為1.62%和1.49%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖1 HXDTM的高效液相色譜圖

2.8 加樣回收率試驗 精密吸取已知丹參素鈉和原兒茶醛含量的HXDTM樣品(批號：20110221)9份，每份1 mL，按大約樣品含量的20%、40%、80%分別加入線性關(guān)系項下的丹參素鈉及原兒茶醛適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下，進樣測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1，表明方法的回收率良好。

表1 回收率實驗結(jié)果(n=9)

2.9 樣品含量測定 取3批HXDTM樣品(批號：20120628、20120816、2011012)，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，樣品量為10 μL，注入高效液相色譜儀，按上述高效液相色譜條件進樣，記錄色譜圖，按外標法計算HXDTM中丹參素鈉和原兒茶醛的含量，結(jié)果見表2。

根據(jù)上述結(jié)果，考慮到每批藥材的產(chǎn)地、質(zhì)量及生產(chǎn)過程中純化水用量及藥材的稱量等所帶來的誤差，暫定本品中每100 mL含丹參素不得少于9.0 mg，含原兒茶醛不得少于1.2 mg。

表2 樣品測定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 流動相的選擇 丹參的水溶性成分丹參素和原兒茶醛均是酚酸類化合物，極性大，在水溶液中易溶解，與空氣接觸極易氧化成醌式結(jié)構(gòu)化合物，在偏堿溶液時更易氧化，使溶液呈桔黃色，在中性流動相中存在著離解平衡而使測定的結(jié)果偏低且色譜峰易產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象，所以，目前在測定上述兩種物質(zhì)時，在流動相中加入適量酸，既抑制其氧化也可抑制其拖尾，乙腈能使色譜峰保持良好的峰形[8-9]。在實驗初期，考察甲醇-磷酸水溶液、甲醇-冰醋酸水溶液、甲醇-乙腈-冰醋酸水溶液[10-16]及不同比例等多個流動相系統(tǒng)的效果，均難以獲得較好的分離度和峰形，結(jié)果選擇乙腈-0.5%冰醋酸作為流動相，分離效果較好[17-18]。

3.2 流動相比例的確定 實驗中考察了混合對照品標準溶液(“2.3”線性關(guān)系考察項下方法制備)在不同比例的乙腈與0.5%冰醋酸的流動相體系下的出峰時間及峰形等的分離效果，在幾個不同流動相比例1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的分離效果中，以乙腈-0.5%冰醋酸為1∶3時分離效果最優(yōu)，峰形對稱，柱效高，保留時間適宜，干擾成分少，丹參素鈉、原兒茶醛均可達到基線分離。

3.3 檢測波長的選擇 實驗是在同一色譜系統(tǒng)中對丹參素鈉和原兒茶醛同時檢測，因此，找到二者共同的最大吸收波長選擇尤為重要。實驗中將丹參素鈉和原兒茶醛對照品溶液分別在200～400 nm波長范圍內(nèi)進行紫外掃描，丹參素鈉和原兒茶醛均在280 nm波長處有最大吸收，且吸收良好，利于含量測定，故選用280 nm作為檢測波長；流動相比例確定以后，考察了流動相對兩種活性成分丹參素鈉和原兒茶醛在280 nm吸收的影響，結(jié)果影響不明顯。

3.4 柱溫的確定 柱溫對于分離的效能也有影響，合適的柱溫能調(diào)整保留時間，提高分離度，在擬定的色譜條件下，調(diào)整柱溫在室溫及30、35、40、50 ℃條件下分別進樣分析，考察柱溫對分離的影響，結(jié)果表明：理論塔板數(shù)N基本隨著溫度升高而增大；隨著柱溫升高，各物質(zhì)峰的保留時間均逐漸提前，這可能是由于溫度升高使化合物在兩相之間的分子運動加快引起；分離度R在室溫時較差，其余溫度下影響不大；不對稱性因子S除室溫和50 ℃較大外，其他均比較理想，故在30～40℃范圍內(nèi)均為適合的柱溫。但考慮到升溫導(dǎo)致色譜柱的穩(wěn)定性差、壽命低，綜合考慮選擇35 ℃為測定柱溫。

3.5 柱長的選擇 在相同色譜條件下，色譜柱長短不一樣時，柱子越長，保留時間就越長。柱長選用150 mm，丹參素鈉的保留時間為5.30 min左右；柱長選用250 mm，其保留時間為8.90 min左右，色譜柱內(nèi)徑小對色譜峰分離效果要好，但測試中產(chǎn)生的壓力也高。因此，實驗選用柱長以250 mm為好。

3.6 流動相的速度 在相同色譜條件下，只改變流動相的速度，進行實驗操作，流動速度增大，保留時間就縮短。實驗中通過調(diào)整流動相比例與流動速度，使其相匹配，產(chǎn)生的色譜峰分離效果好，色譜峰峰形穩(wěn)定、對稱，測得數(shù)據(jù)準確可靠，實驗中實際選用流動相速度為1.0 mL/min。

HXDTM是由丹參等十多味藥材經(jīng)過水提工藝制得的，丹參是方中主藥之一，而水溶性成分丹參素和原兒茶醛是丹參中主要成分，因此，將丹參素和原兒茶醛作為含量考察指標之一，建立了含量測定方法；但中藥復(fù)方制劑的藥效是多種化學(xué)成分共同作用的結(jié)果，單一一味藥中的一種或幾種成分含量的高低并不能全面反映中藥復(fù)方制劑的藥效，方中其他有效成分含量測定的實驗有待進一步研究。本實驗中供試品經(jīng)簡單處理后即可測定，方法簡便、快速、重復(fù)性好、專屬性好，可用于HXDTM的質(zhì)量控制。

參考文獻：

[1] 李全斌,孫芬,何開勇,等.活血定痛合劑的主要藥效學(xué)研究[J].實用藥物與臨床,2012,15(7):414-416.

[2] 舒菁菁,李菲,董雅芬,等.丹參素藥理作用及機制的研究進展[J].藥學(xué)實踐雜志,2012,30(4):266-269.

[3] 李驊,王四旺,張邦樂,等.丹參素的藥理活性與藥物動力學(xué)研究進展[J].西北藥學(xué)雜志,2011,26(4):310-312.

[4] 王煒辰,吳學(xué)輝,鄭芳.丹參藥理學(xué)研究進展[J].海峽藥學(xué),2013,25(10):24-26.

[5] 趙艷威,楊宣,董璨瑾,等.丹參素及原兒茶醛研究進展[J].武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2009,18(3):260-262.

[6] 翟學(xué)佳,徐錦鳳.高效液相色譜法同時測定丹參藥材水溶性和脂溶性成分的含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報,2009,28(10):1345-1348.

[7] 李全斌,李紀元,錢洪波.活血定痛合劑合劑制備及質(zhì)量控制[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2012,14(4):226-228.

[8] 李驊,謝艷華,張邦樂,等.RP-HPLC法同時測定雙丹口服液中沒食子酸、丹參素和原兒茶醛的含量[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2012,9(5):117-119.

[9] 趙晶,曹紅.HPLC法同時測定川參通注射液中丹參素和原兒茶醛的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報,2013,29(2):141-143.

[10]張熙潔,王玉,侯林中,等.寬心口服液中丹參素和原兒茶醛的含量測定[J].中國藥學(xué)雜志,2011,46(19):1530-1531.

[11]劉佩堅,楊輝,蘇健芬,等.HPLC法同時測定復(fù)方丹參輸卵管灌注液中丹參素和原兒茶醛的含量[J].中國藥師,2012,15(7):963-965.

[12]屈蓉,仇雅靜,陳驍鵬,等.高效液相色譜法測定心可舒片中丹參素鈉和原兒茶醛含量[J].中國藥業(yè),2012,21(19):23-25.

[13]尹萌,孟月蘭,聞刑毓,等.不同廠家香丹注射液中丹參素鈉和原兒茶醛含量的比較[J].中國醫(yī)院用藥評價與分析,2010,10(10):903-905.

[14]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:906-907.

[15]靖會,楊黎彬,邊軍昌,等.RP-HPLC法測定丹參不同部位中丹參素和原兒茶醛的含量[J].安徽醫(yī)藥,2011,15(6):691-692.

[16]趙婭柯,張長弓,隆清娥,等.高效液相色譜法測定丹紅片中丹參素和原兒茶醛的含量[J].中國藥師,2012,15(1):68-69.

[17]傅黎春,李桃英,彭棟梁.HPLC法測定丹棗口服液中丹參素及原兒茶醛的含量[J].中國藥師,2009,12(1):72-73.

[18]黃敬群,宋揚.HPLC法同時測定心復(fù)康口服液中丹參素和原兒茶醛的含量[J].西北藥學(xué)雜志,2010,25(4):267-269.