前列腺素E1的工藝優(yōu)化

陳玉威，張?jiān)螺x，董慧明

0 引言

前列腺素(PG)在體內(nèi)由不飽和脂肪酸合成，結(jié)構(gòu)為一個(gè)五環(huán)和兩條側(cè)鏈構(gòu)成的20碳化合物。按其結(jié)構(gòu)，前列腺素分為A、B、C、D、E、F、G、H、I等類型，而前列腺素E1是這個(gè)大家族的一員。前列腺素E1的化學(xué)名稱為(11Α,13E,15S)-11,15-二羥基-9-氧代前列腺-13-烯-1-酸，PGE1為白色或淡黃色針狀結(jié)晶，Mp115～116 ℃，比旋度為-61.6°(c=0.56，THF)。易溶于乙醚(ethyl)?，F(xiàn)有技術(shù)中的前列腺素E1產(chǎn)品收率低，使用受到限制。為使更多患者能充分利用前列腺素E1所研制的各種品種，我們對(duì)前列腺素E1的提取工藝進(jìn)行研究及優(yōu)化的選擇。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 JJ-2(2003-61)組織搗碎勻漿機(jī)；JY98-ⅢDN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；H-1850R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；pHSJ-2F型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-2000E(鞏義予華儀器有限責(zé)任公司)；BP211D型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；日本島津LC2010高效液相色譜儀；色譜柱：Diamonsil-C18柱(200 mm×4.6 mm,5 μm)。

1.2 試劑 氯化鉀、枸櫞酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、EDTA-2Na、氫氧化鉀、氫醌、谷胱甘肽、丙酮、乙醚、石油醚(30～60 ℃)、鹽酸、二氯甲烷、無(wú)水硫酸鈉等，以上試劑均為分析純。乙腈等試劑為色譜純。二高-γ-亞麻酸(通河醫(yī)藥有限公司，純度90%)、 綿羊精囊(黑龍江)。

2 制備方法研究

2.1 制備流程 羊精囊→(KCl,EDTA-Na2,pH8)→酶的混懸液→孵育(氫醌，谷胱甘肽，二高-γ-亞麻酸)→反應(yīng)液→提取(丙酮，乙醚，二氯甲烷)→前列腺素粗品 →前列腺素E粗品(分離，硅膠柱)。

2.2 樣品溶液的制備 酶的制備過(guò)程：取冷藏的羊精囊(-30 ℃)200 g，去除結(jié)締組織和脂肪，加入0.154 mol/L氯化鉀液200 mL，勻漿后，在10 000 r/min下離心10 min，取上清液，以雙層紗布過(guò)濾，得清液。殘?jiān)偌勇然浺?，搗勻漿，離心過(guò)濾后，合并2次上清液。以2 mol/L枸櫞酸調(diào)pH 5±0.2，于10 000轉(zhuǎn)/min下離心15 min，棄除清液，用磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH=8)洗下沉淀，再加等量的 EDTA-2Na(6.25 μmol/L)溶液攪勻，以氫氧化鉀(2 mol/L)調(diào)節(jié)pH 8±0.1，作為酶的混懸液。全部操作一定要在低溫下進(jìn)行。

孵育過(guò)程：取上述混懸液，加入氫醌8 mg和谷胱甘肽100 mg，首先用少量的水溶解氫醌和谷胱甘肽，再加入酶的混懸液中，再加入0.2 g二高-γ-亞麻酸，通氧攪拌，升溫至37 ℃，并保溫38 ℃孵育1 h，反應(yīng)終止得反應(yīng)液95 mL。按二高-γ-亞麻酸純品質(zhì)量計(jì)，酶促轉(zhuǎn)化率為60%。

提?。簩⑸鲜龇磻?yīng)液加入300 mL丙酮攪拌提取1 h，過(guò)濾，濾渣用少量丙酮提取1次，合并濾液，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，除去丙酮。用鹽酸(4 mol/L)調(diào)節(jié)濃縮液至pH 3，以40 mL乙醚分3次振搖提取，棄水層，取醚層，再用30 mL磷酸鹽緩沖液 (0.2 mol/L)分3次振搖提取，每次10 mL，棄醚層取水層。用20 mL石油醚(30～60 ℃)分3次(10、5、5 mL)振搖脫脂，棄醚層取水層。再用鹽酸(4 mol/L)調(diào)pH 3，用20 mL二氯甲烷分3次(10、5、5 mL)振搖提取，加少量無(wú)水硫酸鈉脫水，密塞置冰箱內(nèi)過(guò)夜，濾除硫酸鈉后，在40 ℃以下減壓濃縮得黃色油狀物，得PGS粗品。

2.3 前列腺素E分離 每1 g PGS粗品需用15 g 100～160目的活化硅膠，混懸于三氯甲烷中，濕法裝柱。將PGS溶解于少量三氯甲烷，上柱色譜分離，依次以三氯甲烷、V(三氯甲烷)∶V(甲醇)=98∶2、V(三氯甲烷)：V(甲醇)=96：4的混合液洗脫，硅膠薄層色譜鑒定追蹤，分別收集PGA和PGE部分。在35 ℃以下減壓濃縮，除盡三氯甲烷、甲醇，得PGE粗品。

2.4 前列腺素E提取工藝 采用均勻設(shè)計(jì)法，選擇影響酶轉(zhuǎn)化的4個(gè)主要因素：孵育溫度(A)、pH值(B)、提取時(shí)間(C)、通氧純度(D)為考察指標(biāo)，見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素水平表

3 薄層層析法初步定性分析

前列腺素E的初步定性分析可以使用薄層層析的方法。硅膠G板自然風(fēng)干后,活化2 h，樣品溶液用 20 μL的毛細(xì)管點(diǎn)板，并利用標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照，在展開(kāi)槽內(nèi)直立上行展開(kāi)，平行試驗(yàn)6組。待展開(kāi)自然風(fēng)干后，噴5%磷鉬酸乙醇溶液顯色劑顯色，放烘箱中烘數(shù)分鐘觀察斑點(diǎn)特點(diǎn)，計(jì)算比移值Rf。

4 前列腺素E1的含量測(cè)定

4.1 色譜條件 檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm；流速：1.0 mL/min；流動(dòng)相：乙腈：0.02 mol/L磷酸二氫鉀(pH=4.9±0.5)=30∶70；色譜柱：迪馬C18(200 mm×4.6 mm,5 μm)；進(jìn)樣量：10 μL；理論塔板數(shù)：以前列腺素E1峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

4.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取PGE1對(duì)照品0.5 mg，精密加入25%乙醇溶液5 mL，制成0.1 mg/mLPGE1溶液。精密吸取0.5 mL至5 mL容量瓶中，加25%乙醇溶液定溶至刻度，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜,即得。

4.3 供試品溶液制備 精密稱取自制PGE粗品0.1 mg，精密加入無(wú)水乙醇溶液1 mL，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜,即得。

4.4 含量測(cè)定方法 精密量取供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀中，按“4.4.1”項(xiàng)下條件操作，測(cè)定前列腺素E1吸收峰的峰面積積分值，計(jì)算前列腺素E1含量。 C樣=A樣×C對(duì)/A對(duì)

5 試驗(yàn)結(jié)果

5.1 展開(kāi)劑的優(yōu)選 實(shí)驗(yàn)選擇不同種類及配比的溶劑體系作為展開(kāi)劑，同時(shí)對(duì)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行展開(kāi)，前列腺素E初步分析結(jié)果如表2所示。

通過(guò)表中可以看出，5號(hào)V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(乙酸) =90∶5∶5是比較合適的展開(kāi)劑，PGE1Rf值適中，單向一次薄層層析即能分離出4個(gè)以上顏色較深、集中而清晰可見(jiàn)的斑點(diǎn)，分離效果較理想。如圖1。

表2 硅膠G板不同展開(kāi)劑的薄層層析結(jié)果

圖1 前列腺素E1初步分析薄層圖

表3硅膠G板Rf值平行試驗(yàn)結(jié)果

第1組第2組第3組第4組第5組第6組平均值Rf0.470.450.470.460.450.450.45

5.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 不同孵育溫度、pH值、提取時(shí)間、通氧純度的正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

直觀分析：從表4可以直觀看出，孵育溫度、pH值、提取時(shí)間、通氧純度對(duì)PGE1含量得率都有影響。PGE1提取條件的最優(yōu)組合為：A3B3C2D2，即孵育溫度37 ℃、pH值8、提取時(shí)間1 h、通氧純度為純氧。

表4 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析表

方差分析：結(jié)果見(jiàn)表5和表6。表5 方差分析的結(jié)果表明，孵育溫度有極顯著性影響(P<0.05)。

表5 前列腺素粗品方差分析表

以前列腺素粗品為考察指標(biāo)，表中極差R值大小顯示，各因素主次為A>B>D>C；方差分析結(jié)果表明，A因素的影響具有極顯著意義(P<0.01)，B因素具有顯著意義(P>0.05)，D因素接近顯著值，C因素的影響無(wú)顯著意義，表明本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)較有意義。結(jié)合R水平，得出最佳提取工藝為A3B3C1D1最為合適。

表6 PGE1含量方差分析表

以PGE1含量為考察指標(biāo)，表中極差R值大小顯示，各因素主次為A>D>B>C；方差分析結(jié)果表明，A因素的影響具有極顯著意義(P<0.01)，D因素的影響具有顯著意義(P<0.05)，B因素接近顯著值，C因素?zé)o顯著意義(P>0.05)，表明本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)較有意義。結(jié)合R水平，得出最佳提取工藝為A3B3C1D1最為合適。

綜合以上分析，C因素在兩種考察指標(biāo)中均無(wú)顯著影響。參考實(shí)際工作需要，故確定A3B3C1D1為最終選擇提取條件，即孵育溫度37 ℃、pH值8、提取時(shí)間1 h、通氧純度為純氧。

5.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取綿羊精囊5份，每份1 kg，以上述前列腺素E1最佳提取工藝進(jìn)行提取。測(cè)得PGS粗品及PGE1含量，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 前列腺素粗品三批試驗(yàn)結(jié)果

前列腺素粗品平均值4.13 g，RSD=4.45%；前列腺素E1含量平均值為49.21%，RSD=4.22%，驗(yàn)證結(jié)果說(shuō)明符合正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，該工藝穩(wěn)定可行。

6 討論

6.1 合成酶的選擇及處理 前列腺素合成酶在動(dòng)物組織中以綿羊精囊的含量最高，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)75%，兔腎髓質(zhì)含41%，羊睪丸含18%。綿羊精囊易擇取，好收集，速冷保存于-30 ℃～-20 ℃，放置半年不失其活力。由于前列腺素酶存在于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜微粒體中，需將精囊勻漿經(jīng)離心后，得酶的制劑。

6.2 溫度與pH選擇 最適合溫度37 ℃，綿陽(yáng)精囊合成酶系最適pH 8。pH緩沖液以乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)為最佳，一般在10 min已趨于完成反應(yīng)。

6.3 孵育條件的影響 孵育條件對(duì)PG的產(chǎn)生影響很大，孵育液中加入谷胱甘肽能顯著地增加PGE1的產(chǎn)率，同時(shí)對(duì)PGF的形成起抑制作用。其他含硫基化合物如半胱氨酸、高半胱氨酸、苯硫酚、硫基乙酸和血清白蛋白等都比谷胱甘肽差。

6.4 硝酸銀硅膠薄層色譜 應(yīng)用硝酸銀硅膠板可分離出多種已知的前列腺素，普通硅膠板只能檢出PGA、PGE、PGF，不能檢出僅差一個(gè)雙鍵的PGE1和PGE2。硝酸銀硅膠板的制備：取10 g硅膠G(220目)與1 g硝酸銀，溶于60 mL蒸餾水的水溶液中混合，調(diào)成漿狀，鋪在已除油漬的玻璃板上，待固化后，置105 ℃活化0.5 h后，收藏于棕色干燥器中備用。

6.5 獲得天然PG的方法有生物合成法、化學(xué)合成法和半合成法 采用花生四烯酸為前體，從羊精囊提取前列腺素合成酶，并加入谷胱甘肽、氫醌等輔助刺激劑，在充分給氧的條件下，使花生四烯酸轉(zhuǎn)化成PG，最后分離、提純即得PGE1。其工藝特點(diǎn)是原料豐富、操作簡(jiǎn)便、成本較低。

6.6 有關(guān)PGE1提取工藝的研究報(bào)道較多，本試驗(yàn)不僅在提取方面做了優(yōu)化，主要在分離及精致過(guò)程中做了重點(diǎn)考察，通過(guò)對(duì)PGS粗品的上柱分離，并對(duì)其進(jìn)行硅膠薄層色譜鑒定追蹤，得到PGE粗品。在精致的過(guò)程中，同樣通過(guò)硝酸銀硅膠G薄層鑒定追蹤，PGE1的峰區(qū)集中于Rf值為0.44～0.46得到PGE1結(jié)晶，熔點(diǎn)115～116 ℃。

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