改進的TTC染色法顯示大鼠心肌缺血再灌注損傷

李糧輝，陳文華，鄭宏

(1.福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院麻醉科，福州 350001；2.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院麻醉科，福州 350025)

心肌缺血再灌注損傷是近十幾年來醫(yī)學界研究的熱點之一,其重要的病理特征之一是出現(xiàn)心肌梗死區(qū)。而心肌梗死面積是評價心肌缺血再灌注損傷的一個重要指標[1-3]。2,3,5-氯化三苯基四氮(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色法常用于估計心肌梗死面積[4]。傳統(tǒng)經(jīng)典的TTC心肌染色方法是在心肌取材后進行離體心肌的TTC染色，但因受體外各種條件的影響較大，染色結(jié)果常不盡如人意[5]。我們在實驗過程中，對傳統(tǒng)TTC染色方法進行了改進，本研究通過改進后的TTC染色方法和傳統(tǒng)TTC染色方法的比較來探討TTC染色方法的改進是否對于大鼠缺血再灌注心肌梗死區(qū)的識別度有所提高，以期得到更好的TTC染色方法。

1 材料和方法

1.1 動物及分組

清潔級SD大鼠20只，雄性，8周齡，體重250～300 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供【SCXK(滬)2012-0005]，實驗在福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院心血管內(nèi)科實驗室。按隨機數(shù)字表法將大鼠分為兩組，每組10只，A組：傳統(tǒng)TTC染色法組，B組：改進后的TTC染色法組。

1.2 實驗材料和器材

10%水合氯醛注射液(福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院試劑，批號：120419)；37%～40%甲醛溶液(上海天蓮精細化工有限公司，批號：20090610)；磷酸鹽(PBS)緩沖液(福州中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：20120918)；Evans blue粉劑(美國Sigma公司，批號：00281342)；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)粉劑(美國Amersco 公司，批號：00332543)；手術(shù)器械一套(上海醫(yī)療器械廠)；小動物呼吸機(TKR-200C型，江西特力麻醉呼吸設(shè)備公司)；圖形分析軟件 Image Pro Plus V 6.0 (美國 Media Cybernetics 公司)；數(shù)碼攝像機(LX5型，松下電器(中國)有限公司)。

1.3 大鼠心肌缺血再灌注損傷模型的建立

用10%水合氯醛溶液3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，取仰臥體位固定四肢和牙齒。參考文獻[6-8]的方法，將5個電極針分別插入大鼠的四肢皮下和胸骨體下緣平面與腋前線交匯處皮下，溫控探頭監(jiān)測大鼠肛溫，術(shù)中重點觀察V5、I、II、III導聯(lián)心電圖。并行股靜脈和頸動脈置管。參考文獻[9，10]的方法并改進，用20G靜脈留置針充當氣管導管在大鼠氣管環(huán)甲膜處行環(huán)甲膜穿刺置套管外接小動物呼吸機，行機械通氣(通氣頻率為60次/分，吸呼比為1∶1.5)。取左側(cè)第四肋間開胸，剝離心包，在左心耳下方約2 mm處用眼科小圓針5/0線穿過左冠狀動脈前降支(LAD)下方,可逆性結(jié)扎左冠狀動脈前降支(LAD)，肢體導聯(lián)或胸導聯(lián)心電圖出現(xiàn)ST段抬高0.2 mV以上或者出現(xiàn)增高增寬的QRS波，說明結(jié)扎LAD成功。心肌缺血45 min后松開結(jié)扎線恢復(fù)灌注，逐層縫合、拔除股靜脈和頸動脈處置管，待大鼠開始蘇醒后拔除氣管留置套管，大鼠放歸清潔新籠舍。

1.4 血清CtnI測定

24 h后為再灌注結(jié)束時間，大鼠10%水合氯醛溶液3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，剪開腹腔，用2 mL注射器從下腔靜脈抽取約2 mL血液，裝入離心管，低溫高速離心機離心15 min，轉(zhuǎn)速3000 r/min。將離心分離后的血清分裝入新的離心管內(nèi)，密封，標記，采用全自動生化儀(Beckman DxC800)檢測血清CtnI濃度。

1.5 染色方法

1.5.1 A組參考文獻[11]按照傳統(tǒng)染色方法染色

大鼠心肌缺血再灌注結(jié)束時開胸，由下腔靜脈取血2 mL后重新原位結(jié)扎大鼠LAD，從大鼠下腔靜脈注射1%伊文思藍溶液2 mL，取出心臟，經(jīng)-70℃冰箱速凍15 min后取出，垂直心臟長軸切取5片厚度約1 mm心肌片，立即用二片玻片夾住，輕輕展平以防止皺縮，將5片心肌切片一起放入1% TTC-PBS溶液中37℃恒溫避光水浴15 min,隨后放入4%甲醛溶液中固定12 h。

1.5.2 B組采用改進后的染色方法

大鼠心肌缺血再灌注結(jié)束時開胸，由下腔靜脈取血2 mL后從大鼠下腔靜脈處緩慢注射1% TTC溶液共計1 mL，然后原位結(jié)扎大鼠LAD，再從大鼠下腔靜脈注射1%伊文思藍溶液2 mL，當大鼠口唇變藍時，取出心臟，用生理鹽水沖洗多余染料，用吸水濾紙吸干多余水分，經(jīng)-70℃冰箱速凍15 min后取出?？焖僖源怪毙呐K長軸的角度，從心尖到結(jié)扎結(jié)處平行切取心肌，心尖端的一點心肌棄之不用，剩下部分均勻切成5片，每片厚度約1 mm。不進行TTC溶液水浴和甲醛溶液固定。

1.6 心肌梗死面積測定

染色完成后，數(shù)碼相機拍攝心肌切片圖像,經(jīng)過Image-pro Plus V6.0圖像處理軟件分析計算出梗死區(qū)面積(Infact size, IS)和缺血區(qū)(Area at risk, AAR)的比值，即可計算出心肌梗死面積百分比(IS/AAR%)。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 實驗結(jié)果

2.1 心肌梗死面積百分比(IS/AAR%)

A組心肌切片染色色澤對比度較低，心肌非梗死缺血區(qū)染色多呈灰紅色，梗死區(qū)多呈現(xiàn)灰黃色，心肌非梗死缺血區(qū)和梗死區(qū)區(qū)分度較差，不便于計算機圖形軟件識別處理計算(圖1A)。B組心肌切片染色色澤對比度較高，心肌非梗死缺血區(qū)染色多呈明顯的磚紅色，梗死區(qū)多呈現(xiàn)黃白色，心肌非梗死缺血區(qū)和梗死區(qū)區(qū)分度較好，便于計算機圖形軟件識別處理計算(圖1B)。A組心肌梗死面積(48.69±5.37)%，B組心肌梗死面積(47.41±3.28)%；二組心肌梗死面積無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見圖2所示。圖1見彩插13。

圖2 心肌梗死面積百分比

2.2 血清cTnI濃度

A組血清cTnI濃度為(4.51±0.88)ng/mL，B組血清cTnI濃度為(4.70±0.71)ng/mL；二組血清cTnI濃度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 大鼠血清cTnI濃度

3 討論

氯化三苯基四氮唑(TTC) 染色是一種用來檢測實驗動物心臟梗死面積最常見的染色方法[12]。因其染色后顏色較易觀察且靈敏性高而被廣泛用于狗、大鼠、貓、豬的心肌或腦組織缺血模型梗死面積的評估[13-18]。其原理是TTC (2，3，5-氯化三苯基四氮唑)是生物呼吸鏈中吡啶核苷結(jié)核酶系統(tǒng)的質(zhì)子受體，它與非梗死組織中的脫氫酶反應(yīng)產(chǎn)生紅色的甲臜(fromazan)[19]，而梗死組織內(nèi)脫氫酶活性下降，不能反應(yīng)，故不會產(chǎn)生變化呈蒼白色[20-21]。

以往文獻[5，22]中的TTC心肌染色法通常為傳統(tǒng)的染色法，其大致步驟為先進行Evans blue的心肌非缺血區(qū)染色并心肌取材，后在冰箱里速凍，然后再進行心肌切片，接著在37℃恒溫的水浴箱內(nèi)進行TTC染色，最后在放入甲醛溶液中固定。改進后的TTC染色方法則是先進行大鼠在體的心肌TTC染色，然后再進行Evans blue的染色，直接取心臟冷凍后切片，無需水浴步驟和甲醛固定。前者步驟為Evans blue染色—取心臟—心肌冷凍后切片—水浴和TTC染色—甲醛固定，而后者步驟為在體TTC染色和Evans blue染色—取心臟—心肌冷凍后切片，顯然后者簡單方便。

傳統(tǒng)的染色法是利用37℃水浴模擬動物存活時的體溫進行TTC染色。但是，水浴溫度無法完全等同于動物存活時的體溫，而且，在進行TTC染色前需要經(jīng)過Evans blue染色和心肌速凍，可能使心肌中的脫氫酶部分失活，導致體外環(huán)境中脫氫酶活性通常難以達到在體的水平；另外，水浴只能通過TTC滲透心肌切片表面來反應(yīng)，反應(yīng)相對較慢，TTC染色過程容易受到已染的Evans blue染色劑的影響，還需要甲醛固定來增加染色對比度；此外，在冰凍后水浴過程中，心肌組織往往會過度皺縮導致不夠平整。這些因素都影響了TTC染色的效果。改進后的TTC染色采用的是在體TTC染色，反應(yīng)溫度恒定，而且，先在體TTC染色后Evans blue染色和心肌速凍，不影響脫氫酶的水平和活性，TTC通過血液循環(huán)迅速地與活體心肌中的脫氫酶起反應(yīng)，不受Evans blue染色劑的影響，提高了染色效果，也節(jié)約了大量的實驗時間。本研究中可見，A組心肌切片染色色澤對比度較低，心肌非梗死缺血區(qū)染色多呈灰紅色，梗死區(qū)多呈現(xiàn)灰黃色，心肌非梗死缺血區(qū)和梗死區(qū)區(qū)分度較差； B組心肌切片染色色澤對比度較高，心肌非梗死缺血區(qū)染色多呈明顯的磚紅色，梗死區(qū)多呈現(xiàn)黃白色，心肌非梗死缺血區(qū)和梗死區(qū)區(qū)分度較好。動物的心肌缺血再灌注實驗往往會涉及到具有心肌保護作用的藥物，而使用心肌保護藥物處理后的動物，心肌梗死面積往往縮小，而且不同藥物濃度梯度的亞組間梗死面積往往也有所不同但差異比較小。如果此時仍然采用傳統(tǒng)TTC染色，往往因為染色效果不佳而影響各個藥物亞組間的對比，增加實驗誤差，所以采用改進后的TTC染色法，可以提高藥物各亞組染色效果，進一步減少實驗誤差。

血清cTnI是衡量大鼠心肌損傷的敏感性指標。本研究比較了A組和B組的血清cTnI，顯示兩組之間血清cTnI差異無統(tǒng)計學意義?？梢姼倪M后的TTC染色方法對大鼠的心肌損傷不影響，也間接說明了不同的TTC染色方法因其染色效果的好壞可以影響到實驗結(jié)果的判定，甚至可能導致實驗誤差增大。

傳統(tǒng)TTC染色由于需要進行心肌切片的浸沒后的TTC水浴，所以通常需要10～20 mL的TTC溶液，而改進后的TTC染色法只要在體注射非常少量的TTC溶液即可，節(jié)約了TTC用量進而節(jié)約實驗經(jīng)費。

綜上所述，改進后的心肌TTC染色法操作簡便，節(jié)省了實驗時間和經(jīng)費，提高了染色效果，能更準確地反映心肌缺血再灌注損傷的程度，是一種經(jīng)濟、簡便、快捷、高效的染色方法。

(本文圖1見彩插13。)

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