CFTR基因在小鼠腸道組織中的差異表達(dá)

王月影，韓瑩倩，查光明，汪新建，李和平

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生化與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002)

1989年Riordan等[1]克隆了囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)體(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR)，1991年CFTR被確定為氯離子選擇性通道，從而開始了對(duì)CFTR作為Cl-通道的系統(tǒng)研究。CFTR分布廣泛，諸如腸道、肺、肝、胰腺、生殖腺等的細(xì)胞均有表達(dá)[2]。CFTR是受cAMP激活的Cl-通道蛋白，是ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)體超家族的一名特殊成員，由五個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)核苷酸結(jié)合域和一個(gè)特殊的調(diào)控域[3,4]。

CFTR通過支架蛋白與其他膜受體以及蛋白激酶、磷酸酶形成大分子信號(hào)復(fù)合體，在復(fù)雜的細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng)參與下，CFTR的功能活動(dòng)在時(shí)間和空間上得到精確的調(diào)控[1]。CFTR是決定上皮細(xì)胞跨膜鹽分的運(yùn)輸、液體流動(dòng)和離子濃度的中心。CFTR在腸、胰腺和汗腺的水和電解質(zhì)分泌中發(fā)揮關(guān)鍵作用，參與汗腺導(dǎo)管和呼吸道上皮細(xì)胞液體和電解質(zhì)的吸收[5]，研究表明CFTR缺陷的動(dòng)物表現(xiàn)人類囊性纖維化病的許多特點(diǎn)，如呼吸道Cl-轉(zhuǎn)運(yùn)和黏膜下層腺體分泌障礙，胰腺、肝臟和輸精管疾病，早期肺部感染等[6]。CFTR缺陷的豬表現(xiàn)為胃腸道異常和某些方面的肺部疾病，如胎糞性腸梗阻，所有新生CFTR缺陷小豬患有腸梗阻，膽囊發(fā)育受阻[7]。CFTR活性過高會(huì)引發(fā)分泌性腹瀉等疾病，且內(nèi)毒素誘導(dǎo)的腹瀉與CFTR活性升高密切相關(guān)[8]。目前已經(jīng)利用分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)能特異阻斷CFTR通道的抑制劑，極有可能成為新型的抗分泌性腹瀉藥物。

腸道不僅是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收的器官，也是機(jī)體重要的保護(hù)性屏障。腸黏膜是機(jī)體抵抗外源物質(zhì)及微生物的重要免疫屏障，同時(shí)也是全身器官的“受損門戶”，腸源性感染可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體多臟器功能衰竭。因此，完整的腸黏膜及其免疫系統(tǒng)在抵抗病原微生物感染中具有重要的作用。腹瀉主要是由于腸上皮細(xì)胞對(duì)離子及溶質(zhì)的吸收與分泌平衡產(chǎn)生紊亂，隨后伴隨大量水進(jìn)入腸管并刺激腸蠕動(dòng)增加所引起。通常，這種平衡紊亂是由于細(xì)菌分泌毒素?fù)p傷上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)而造成的。脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的成分，在正常及病理情況下主要通過胃腸道進(jìn)入體內(nèi)，可使人和動(dòng)物出現(xiàn)腹瀉等應(yīng)激反應(yīng)[7,9]，診治延誤常出現(xiàn)致死病例。

多年來通過對(duì)CFTR通道結(jié)構(gòu)與功能的研究，人們對(duì)CFTR通道的門控機(jī)制及活性的調(diào)節(jié)有了深入的認(rèn)識(shí)。但對(duì)于發(fā)生腹瀉時(shí)不同腸段CFTR基因表達(dá)研究尚少，因此本實(shí)驗(yàn)利用LPS建立動(dòng)物分泌性腹瀉模型，闡明CFTR基因在不同腸段的表達(dá)差異，初步探討腹瀉時(shí)CFTR基因表達(dá)的變化，為進(jìn)一步以CFTR為作用靶點(diǎn)進(jìn)行分泌性腹瀉治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取2月齡SPF級(jí)KM小鼠24只(雌雄各半)，且不存在腸先天性離子交換缺陷，體重(50±5)g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(豫)2005-0001]，實(shí)驗(yàn)在農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生化與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。在12 h光照和12 h黑暗的條件下喂養(yǎng)，飼喂小鼠全價(jià)顆粒飼料，環(huán)境溫度20～25℃，自由采食和飲水。隨機(jī)分為：對(duì)照組(0 h)、注射LPS 1 h組(1 h)、注射LPS 8 h組(8 h)，每組8只。1 h和8 h組小鼠分別經(jīng)腹腔注射6 mg/(kg·bw) LPS(方法參考文獻(xiàn)[8])，于注射后 1 h和8 h采集組織樣品；對(duì)照組小鼠經(jīng)腹腔注射等量的生理鹽水，于注射后8 h采集組織樣品；注射后隨時(shí)觀察記錄小鼠精神、食欲、毛色、糞便(外觀形狀、顏色、氣味等)、死亡狀況等。若小鼠精神萎靡、少動(dòng)或激惹躁動(dòng)，大便性狀為黏液、稀便則視為造模成功[10]。

1.2 儀器及試劑

1.2.1 主要試劑

大腸桿菌LPS(Sigma，O55:B5)，RNAiso Plus、dNTP、M-MLV reverse transcriptase、random primer、MLV、SYBR green、CFTR引物來自TaKaRa公司，DNase、DNase buffer、stop solution來自Promega公司，其他普通試劑均為分析純。

1.2.2 主要儀器

高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf, Germany)；高速組織勻漿機(jī)(IKA，廣州儀科)；Gel Doc-It imaging System凝膠成像系統(tǒng)(UVP, USA)；熒光定量PCR儀(Eppendorf, Germany)；微量分光光度計(jì)(Thermo Scientific公司)；萊卡切片機(jī)；Motic顯微鏡及成像系統(tǒng)等。

1.3 腸道組織采集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用10%水合氯醛0.35～0.4 mL/(100 g/ bw)經(jīng)腹腔麻醉小鼠，麻醉后打開腹腔，分別取十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸組織置液氮速凍，-80℃保存待測(cè)，另取一段十二指腸置4%多聚甲醛進(jìn)行固定，用做石蠟切片。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 腸道組織病理變化

取固定24 h的小鼠腸道組織經(jīng)過沖水，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋等處理后，以5 μm 的厚度切片，常規(guī)蘇木素-伊紅(H.E)染色，顯微鏡觀察成像。

1.4.2 腸道組織CFTR基因的表達(dá)

以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為看家基因，采用熒光定量PCR法測(cè)定小鼠十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸中CFTR基因的轉(zhuǎn)錄水平。

(1)PCR引物的設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)GenBank中GAPDH和CFTR的mRNA序列，設(shè)計(jì)GAPDH的引物序列：F: tgcaccaccaactgcttag，R: gatgcagggatgatgttc，擴(kuò)增子175 bp；CFTR的引物序列：F: tgaacacagga tagaagcgatgttg，R: ggagctaatggcctgctgga，擴(kuò)增子130 bp。引物由TaKaRa公司合成。

(2)腸道組織總RNA提取及cDNA合成

小鼠腸道組織總RNA的提取按RNAiso Plus說明書進(jìn)行，微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度和濃度，-80℃保存。cDNA合成參考M-MLV說明書進(jìn)行。

(3)熒光定量PCR

單個(gè)樣品的CFTR基因均作3孔重復(fù)以減少實(shí)驗(yàn)誤差，每個(gè)樣品均有看家基因GAPDH作為對(duì)照。PCR反應(yīng)體系為：SYBR green mix 5 μL；上下游引物 (20 pmol/μL) 各0.1 μL；nuclease-free water 3.55 μL；Total 10 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。熒光信號(hào)采集設(shè)置在PCR反應(yīng)延伸階段，閾值及基線采取軟件自動(dòng)生成。擴(kuò)增程序設(shè)置之后，插入熔解曲線反應(yīng)程序，具體程序?yàn)椋?5℃ 15 s，60℃ 15 s，95℃ 15 s。

(4)熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析

以GAPDH基因作為內(nèi)參基因，分別用對(duì)照組腸道組織和十二指腸組織的mRNA表達(dá)量作為對(duì)照，通過公式計(jì)算實(shí)驗(yàn)組和各腸段組織中CFTR基因相對(duì)表達(dá)量：Ratio=Etarget△Cttarget (control-sample)/ Ereference△Ctref (control-sample), 其中ratio為mRNA相對(duì)表達(dá)量；Etarget為目的基因擴(kuò)增效率；Ereference為內(nèi)參基因擴(kuò)增效率，Ctcontrol為對(duì)照組的Ct值，Ctsample為樣品組的Ct值。對(duì)mRNA相對(duì)表達(dá)量采用SPSS 13統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，組間差異比較用F檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的活動(dòng)特征

實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)照組小鼠精神良好，飲食、毛色、排便情況均正常；LPS注射后1 h和8 h后小鼠出現(xiàn)不同程度的腹瀉，部分小鼠出現(xiàn)松軟大便、黏液便、稀便，精神萎靡、行動(dòng)遲緩，采食量有所下降。提示LPS成功地誘導(dǎo)小鼠發(fā)生了分泌性腹瀉。

2.2 小鼠腸道組織病理學(xué)變化

小鼠腸道組織病理學(xué)變化見圖1(彩插8)。由圖1可知，對(duì)照組小腸黏膜基本正常，絨毛排列基本整齊，部分固有層、黏膜下層輕度水腫，腸腺正常。LPS注射組小腸絨毛呈現(xiàn)損傷，部分頂部絨毛脫落，上皮下間隙擴(kuò)大，腸腺不同程度的損傷，固有層、黏膜下層呈現(xiàn)中度至高度水腫，出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管充血，淋巴管擴(kuò)張。LPS注射1 h后，黏膜及絨毛排列輕度紊亂，絨毛縮短，無(wú)黏膜變性、壞死，出現(xiàn)上皮細(xì)胞下間隙增大，腸腺輕度受損，毛細(xì)血管充血；注射后8 h，小腸絨毛明顯水腫，絨毛排列紊亂，絨毛黏膜糜爛脫落，腸腺受損，毛細(xì)血管發(fā)生明顯充血，有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.3 CFTR的熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

CFTR的熒光定量檢測(cè)結(jié)果見圖2(彩插8)。由圖2可知，該組樣品中溶解曲線均較集中，出現(xiàn)一個(gè)溶解曲線高峰群，基本上沒有雜峰出現(xiàn)，說明CFTR基因濃度較純正，基本上沒有其他雜物基因出現(xiàn)。這些樣品基因中溶解高峰值不同，說明不同腹瀉時(shí)間CFTR在不同部位的表達(dá)量不同。

2.4 各腸段中CFTR基因的轉(zhuǎn)錄水平

各腸段中CFTR基因的轉(zhuǎn)錄水平見圖3。由圖3可知，小鼠十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸中均有CFTR基因的表達(dá)，且各腸段的表達(dá)豐度不同，以結(jié)腸表達(dá)量最高，其次是回腸、十二指腸，空腸表達(dá)量最低。CFTR在各腸段表達(dá)的差異提示，各腸段在依靠CFTR轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌Cl-方面有差異。

圖3 CFTR基因在各腸段中的轉(zhuǎn)錄水平

2.5 LPS對(duì)小鼠各腸段中CFTR基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

LPS對(duì)小鼠各腸段中CFTR基因轉(zhuǎn)錄水平的影響見圖4和表1。由圖4和表1可知，注射LPS后，十二指腸、空腸和回腸的CFTR基因轉(zhuǎn)錄水平均發(fā)生上調(diào)，且隨LPS作用時(shí)間的延長(zhǎng)，十二指腸CFTR基因轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，空腸和回腸的CFTR基因轉(zhuǎn)錄有所下調(diào)，但仍高于對(duì)照組，而結(jié)腸CFTR基因轉(zhuǎn)錄水平的變化恰好相反，隨注射時(shí)間的延長(zhǎng)，呈下調(diào)的變化趨勢(shì)。

與對(duì)照組相比，1 h和8 h組的CFTR基因在十二指腸、空腸、回腸中的表達(dá)上調(diào)，十二指腸的1 h組、空腸的1 h組和8 h組差異有顯著性(P<0.05)；十二指腸的8 h組、回腸的1 h組和8 h組差異無(wú)顯著性(P>0.05)。與對(duì)照組相比，結(jié)腸中1 h組CFTR基因的表達(dá)無(wú)變化，8 h組CFTR基因的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。結(jié)果提示，LPS誘導(dǎo)腹瀉的發(fā)生與腸道CFTR基因轉(zhuǎn)錄水平的變化密切相關(guān)，且各腸段發(fā)揮的作用不同，尤其是空腸在Cl-分泌中發(fā)揮主要作用，結(jié)腸的作用最弱。

圖4 LPS對(duì)小鼠各腸段CFTR基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

表1 CFTR基因在小鼠腸道中的表達(dá)

3 討論

小腸的基礎(chǔ)分泌和各種生理性刺激引起分泌的液體和電解質(zhì)主要是為了消化食物，分泌主要發(fā)生在小腸隱窩，產(chǎn)生一種包含小分子的等滲溶液，便于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收。腸管分泌與吸收過程的平衡主要依靠有絨毛的上皮細(xì)胞來維持。腹瀉主要是由于腸絨毛上皮細(xì)胞對(duì)液體的吸收與腸腺分泌平衡產(chǎn)生紊亂，伴隨大量水進(jìn)入腸管所引起。盡管有很多因素能引起腹瀉，但細(xì)菌分泌毒素造成腸絨毛上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞是引起腹瀉的原因之一[11]。

細(xì)菌毒素通過特異性攻擊信號(hào)分子cAMP或細(xì)胞內(nèi)Ca2+，激活細(xì)胞Cl-通道，引起Cl-和水分泌增加。CFTR是腹瀉病原菌識(shí)別的最終靶位，可以促進(jìn)Cl-的分泌增加和Cl-吸收降低，最終使腸管中Cl-的濃度增加[8]。Thiagarajah等[12,13]提出細(xì)菌和腸毒素引起的分泌性腹瀉，主要是由于小腸上皮細(xì)胞cAMP或Ca2+信號(hào)通路激活，提高腸上皮細(xì)胞游離面Cl-通道的通透性，同時(shí)Na+離子吸收下降。Marchelletta等[14]發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌感染BALB/c小鼠引起腹瀉，結(jié)腸組織cAMP依賴的離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)降低，Cl-和鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生改變，而CFTR在結(jié)腸隱窩發(fā)生內(nèi)化，改變了結(jié)腸水轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)及功能。Rogers等[15]發(fā)現(xiàn)CFTR是腸毒素引起腹瀉的主要作用分子，證實(shí)細(xì)胞內(nèi)能量敏感激酶、AMP激活蛋白激酶能抑制CFTR開放，藥理學(xué)研究激活A(yù)MP激活蛋白激酶能有效降低霍亂毒素引起的腸細(xì)胞分泌Cl-。Sandle等[16]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的分泌性腹瀉可引起腸細(xì)胞上CFTR活性升高。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LPS作用1 h和8 h均可上調(diào)十二指腸、空腸、回腸中CFTR基因的表達(dá)；結(jié)腸1 h組CFTR基因的表達(dá)無(wú)變化，8 h組CFTR基因的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。提示LPS通過上調(diào)十二指腸、空腸和回腸組織中CFTR基因的表達(dá)，提高了Cl-的分泌，進(jìn)而誘導(dǎo)小鼠腹瀉。

(本文圖1,2見彩插8。)

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