抑制T細(xì)胞增殖的抗CD45單克隆抗體的建立

蘇澤紅，李亞林，譚翔文，余堅(jiān)，劉鑫，袁月親，練高建

(1.南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部， 湖南 衡陽 421001；

2.南華大學(xué)藥學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，湖南 衡陽 421001)

CD45，又可稱之為B220、CD45R、CD45RA、CD45RB、CD45RC、EC3.1.3.48、LCA、T200、Ly5和PTPRC。 Trowbridge等[1]研究表明CD45 CD45RO是白細(xì)胞表面共同抗原(leukocyte common antigen,LCA)，在所有白細(xì)胞上都有表達(dá)，并且已經(jīng)證實(shí)在各種不同的哺乳動(dòng)物，雞、鯊魚及紅鰭東方豚中，都有CD45同系物存在。CD45是一種表達(dá)在所有有核造血細(xì)胞及其前體表面均有表達(dá)的I型轉(zhuǎn)膜分子。Fellberg等[2，4]研究證實(shí)，CD45參與多種免疫功能，尤其對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和活化具有重要的調(diào)節(jié)作用。Johnson等[3,5]研究證實(shí)，CD45是細(xì)胞膜上信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵分子，在淋巴細(xì)胞的發(fā)育成熟，功能調(diào)節(jié)及信號(hào)傳遞中具有重要意義。但CD45是否在T細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮作用，迄今未見相關(guān)報(bào)道。

我們使用來源于BALB/c小鼠骨髓的樹突狀細(xì)胞對(duì)大鼠進(jìn)行免疫，然后得到許多可以識(shí)別T細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞的雜交瘤細(xì)胞，其中一株雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體對(duì)CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖有最強(qiáng)的抑制作用。對(duì)其進(jìn)行的更進(jìn)一步的分析，表明該雜交瘤所分泌的抗體的目標(biāo)分子是CD45。T細(xì)胞的異常增殖在自身免疫性疾病如1型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用?；诖?，有必要深入研究抗CD45單克隆抗體是否能預(yù)防治療一些與T細(xì)胞異常增殖誘導(dǎo)的相關(guān)疾病。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞

6～8周齡BALB/c小鼠10只，南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部自繁自養(yǎng)【SCXK(湘)2010-0004】；6～8周齡Wistar 大鼠9只，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(粵)2011-0015】，均為雌性，飼養(yǎng)于南華大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房【SYXK(湘)2010-0006】。SP2/0骨髓瘤細(xì)胞系，293T細(xì)胞系，均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 試劑

完全及不完全RPMI-1640培養(yǎng)液，聚乙二醇(PEG1500)，HAT培養(yǎng)液，均購自Sigma公司。小鼠抗大鼠IgG抗體，蛋白G瓊脂糖，銀染試劑盒，均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 免疫程序及融合

參見參考文獻(xiàn)[9]。

1.4 增殖反應(yīng)實(shí)驗(yàn)

收集BALB/c小鼠脾臟制備細(xì)胞懸液。離心后加入CFSE溶液(9000倍稀釋)于37℃水浴鍋遮光培養(yǎng)15 min，1500 r/min 4℃離心5min，然后用PBS 1500 r/min 4℃離心5 min，清洗2次，最后加入RPMI培養(yǎng)液和抗CD3單克隆抗體(1∶1000)，并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至24孔培養(yǎng)板，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。

1.5 Western blot

從BALB/c小鼠收集脾細(xì)胞，加入裂解緩沖液作用約15 min，然后離心收集上清，經(jīng)10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳90 min，再以150 mA電流持續(xù)轉(zhuǎn)膜60 min，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。加封閉液封閉1 h后加入一抗(1∶10)，4℃孵育過夜。過夜后復(fù)溫至室溫，0.1% PBST緩沖液洗膜5 min × 3次，加入二抗(1∶1000)，37℃孵育45 min，再用0.1% PBST緩沖液洗膜5 min × 3次，最后用PBS洗15 min。加入等比例的化學(xué)發(fā)光試劑A和B后，直接在成像儀進(jìn)行顯影與采圖。

1.6 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)

參見參考文獻(xiàn)[9]。

1.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

使用GeneJuice (Merck公司)轉(zhuǎn)染試劑，分別將pcDNA3.1空白載體或pcDNA3.1裝載小鼠CD45cDNA后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，然后用博來霉素處理得到穩(wěn)定的CD45表達(dá)細(xì)胞。

本文中所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上。

2 結(jié)果

2.1 建立有效抑制CD4+和CD8+ T細(xì)胞增殖的單克隆抗體

收集純化BALB/c小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞，腹腔注射免疫Wistar大鼠，獲得大量能夠識(shí)別小鼠樹突狀細(xì)胞或T細(xì)胞的雜交瘤細(xì)胞系。細(xì)胞增殖反應(yīng)實(shí)驗(yàn)得到很多株具有抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖效果的雜交瘤細(xì)胞系，其中一株對(duì)CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖具有最強(qiáng)的抑制效果(圖1，彩插3)，我們將其命名為F3-6，對(duì)其進(jìn)行深入研究揭示其目標(biāo)分子。

2.2 Western blot 檢測(cè)F3-6識(shí)別的目標(biāo)蛋白

如圖2所示，與F3-6反應(yīng)的泳道內(nèi)在約250×103處出現(xiàn)一條特異性的蛋白條帶，而對(duì)照抗體Rat IgG的泳道內(nèi)則沒有出現(xiàn)蛋白條帶。

圖2 F3-6 識(shí)別的目標(biāo)蛋白位于約250×103處(C：對(duì)照IgG抗體)

2.3 單克隆抗體識(shí)別的目標(biāo)分子

將從BALB/c小鼠收集的全脾細(xì)胞的裂解液與F3-6單克隆抗體進(jìn)行免疫共沉淀反應(yīng)，然后將其轉(zhuǎn)移到凝膠上進(jìn)行電泳。電泳后的凝膠進(jìn)行銀染，結(jié)果表明，目標(biāo)帶位于約250×103(圖3A)。對(duì)切割后的目標(biāo)帶進(jìn)行液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析，顯示F3-6單克隆抗體識(shí)別的目標(biāo)分子為CD45；為進(jìn)一步驗(yàn)證F3-6單克隆抗體識(shí)別CD45分子，我們分別用空白載體或裝載有小鼠CD45的cDNA的載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，然后與我們制備的F3-6單克隆抗體進(jìn)行反應(yīng)，再與PE-連接的抗大鼠IgG抗體反應(yīng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，在過表達(dá)CD45的293T細(xì)胞系中，出現(xiàn)與F3-6反應(yīng)的陽性結(jié)果(圖3B)。上述結(jié)果表明，F(xiàn)3-6單克隆抗體識(shí)別小鼠CD45。

圖3 F3-6識(shí)別CD45(目標(biāo)帶位于約250×103處)(C：對(duì)照IgG抗體)

3 討論

CD45，又可稱之為B220、CD45R、CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RO、EC3.1.3.48、LCA、T200、Ly5和PTPRC。 是白細(xì)胞表面共同抗原(leukocyte common antigen, LCA)，在所有白細(xì)胞上都有表達(dá)，并且已經(jīng)證實(shí)在各種不同的哺乳動(dòng)物、雞、鯊魚及紅鰭東方豚中，都有CD45同系物存在。Thomas等[6]的研究表明CD45是一種在所有有核造血細(xì)胞及其前體表面均有表達(dá)的I型轉(zhuǎn)膜分子。Trowbridge等[1]研究證實(shí)，在各種不同的哺乳動(dòng)物、雞、鯊魚及紅鰭東方豚中，都有CD45同系物存在。還有研究表明，在T細(xì)胞及B細(xì)胞中，多達(dá)10%的細(xì)胞表面區(qū)域由CD45組成。CD45參與多種免疫功能，尤其對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和活化具有重要的調(diào)節(jié)作用。Byth等[13-16]在應(yīng)用CD45突變細(xì)胞系和CD45缺陷小鼠所做的實(shí)驗(yàn)中證實(shí), 在淋巴細(xì)胞活化所必需的T細(xì)胞抗原受體(TCR)和B細(xì)胞抗原受體(BCR)所介導(dǎo)的信號(hào)通路中, CD45起著關(guān)鍵的正調(diào)節(jié)作用。CD45由一類結(jié)構(gòu)相似，分子量較大的跨膜蛋白組成，廣泛存在于白細(xì)胞表面，是細(xì)胞膜上信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵分子，在淋巴細(xì)胞的發(fā)育成熟，功能調(diào)節(jié)及信號(hào)傳遞中具有重要意義[2-4]。Western blot和免疫共沉淀結(jié)果表明，我們所構(gòu)建的單克隆抗體，目標(biāo)帶位于約250×103處。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析及細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果表明其目標(biāo)分子為CD45。同時(shí)，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，抗CD45單克隆抗體能有效抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖，提示CD45在T細(xì)胞的增殖過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,但CD45究竟以何種方式經(jīng)何種途徑對(duì)T細(xì)胞的增殖發(fā)揮有效抑制作用仍需進(jìn)行進(jìn)一步的研究予以闡明。

很多實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，以T細(xì)胞介導(dǎo)為主的自身免疫性疾病中，如自身免疫性甲狀腺病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，自身反應(yīng)性T細(xì)胞直接參與其中，作為效應(yīng)細(xì)胞識(shí)別和攻擊帶有特異自身抗原的靶細(xì)胞所引發(fā)[7,8]。T細(xì)胞表面表達(dá)有大量的共刺激分子，如CD3、CD98等，對(duì)T細(xì)胞的增殖、功能分化及存活起著正調(diào)或負(fù)調(diào)作用[9]。大量的研究證實(shí)[10,11]對(duì)這些共刺激分子的作用進(jìn)行修飾可以有效的調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能，并且研究人員已經(jīng)從這些實(shí)驗(yàn)研究中開發(fā)出大量的試劑，比如以共刺激分子受體或配基為作用目標(biāo)的單克隆抗體或者重組的可溶性配基，用于T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病的治療。

本文所構(gòu)建的抗CD45單克隆抗體，能有效地抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖，我們將對(duì)其進(jìn)行更深入的研究，探索其對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病的預(yù)防和治療作用，為將來的臨床應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

(本文圖1見彩插3。)

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