利用TALE-TFs在小鼠成纖維細胞中激活β-酪蛋白基因啟動子表達載體

皮文輝，梁龍，唐紅，張譯元，郭延華，王立民，向春和，周平，劉守仁

(1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團綿羊繁育生物技術(shù)重點實驗室，新疆 石河子 832000；

2.新疆埃樂欣藥業(yè)有限公司，烏魯木齊 830013；3.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003)

1987年Gordon等[1]采用原核顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)，獲得乳腺生物反應(yīng)器小鼠模型。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系的發(fā)展，乳腺生物反應(yīng)器的研究也取得了相應(yīng)發(fā)展。酪蛋白是哺乳動物乳中主要的蛋白組份，根據(jù)結(jié)構(gòu)劃分為4類：αs1、αs2、β和κ[2]。哺乳動物β-酪蛋白基因在乳腺中高表達[2,3]，皮膚[4]和有毒T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes)[5]中也表達。敲除β-酪蛋白基因小鼠能夠正常生長、繁殖和哺育后代[6]。β-酪蛋白基因啟動子是構(gòu)建乳腺生物反應(yīng)器表達框的候選啟動子。

為證實β-酪蛋白基因啟動子驅(qū)動的表達框是否有效，Kolb等[7](1999)采用乳腺上皮細胞。國內(nèi)乳腺生物反應(yīng)器研究方面，也采用乳腺上皮細胞驗證乳腺特異性表達框的有效性[8]。如果能夠在成纖維細胞中激活β-酪蛋白基因啟動子，檢測重組表達框的表達結(jié)果，將為β-酪蛋白基因啟動子表達載體檢測，提供另外一種簡便的檢測途徑。

快速發(fā)展的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)子(transcription activator-like effector, TALE)技術(shù)，已經(jīng)成為基因組編輯(genome editing)和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控(transcriptional modulation)的有效工具[9,10]。TALE來源于黃單胞桿菌(Xanthomonassp.)，TALE-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域由串聯(lián)重復(fù)單元組成，大部分單元含34(33～35)個氨基酸，單元的第12和13位氨基酸高度可變，稱為重復(fù)可變區(qū)(repeat-variable diresidues, RVDs)[11]。TALE的RVDs識別DNA序列的4個堿基具有高度的專一性，TALE重復(fù)單元的第13位氨基酸直接與DNA的堿基特異結(jié)合[12,13]。研究者幾乎能夠針對任何DNA靶序列，構(gòu)建特異性TALE-DNA結(jié)合域，在靶向改變基因序列和調(diào)控基因表達方面具有廣泛的用途。

TALE—TF代表TALE-TFs靶向位點；TATA代表TATA box；E1代表β-酪蛋白基因第一外顯子；Red-polyA代表紅色熒光蛋白基因和Sv40 polyA序列

TALE-DNA結(jié)合域串聯(lián)VP64轉(zhuǎn)錄激活因子，構(gòu)成TALE轉(zhuǎn)錄因子(TALE transcription factors, TALE-TFs)。TALE特異結(jié)合DNA，VP64同真核細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子作用，招募RNA聚合酶和其它因子，穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合體(transcription preinitiation complex)，間接調(diào)控特定基因轉(zhuǎn)錄[14,15]。TALE-TFs即能提高表達基因的轉(zhuǎn)錄水平，還能激活在特定細胞中不表達的基因[15-17]。本研究利用TALE-TFs，在小鼠成纖維細胞中，成功激活β-酪蛋白基因啟動子，為檢測β-酪蛋白基因啟動子—外源基因表達框表達結(jié)果，提供了一種檢測方法。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗動物

SPF級KM鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2012-0001】。雌雄各2只，10周齡，雄鼠體重36g，雌鼠體重30g，飼養(yǎng)在新疆農(nóng)墾科學(xué)院實驗動物房，自然交配后，取妊娠18d的KM孕鼠，留待實驗。

1.1.2 試劑

TALE Toolbox試劑盒(Addgene，1000000019)。Herculase II fusion polymerase 購自Agilent Technologies；Esp3I(BsmBI)、AfeI購自Fermentas；BsaI-HF購自New England Biolabs；T7 DNA ligase購自Enzymatics；PlasmidSafe ATP-dependent DNase購自Epicentre；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒等試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司；1 kb DNA ladder購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Marker VII、DH5a大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細胞購自天根生化科技(北京)有限公司；核酸染料GELVIEW購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

1.2 小鼠β-酪蛋白基因啟動子—Red報告基因表達載體構(gòu)建

本實驗室應(yīng)用“Golden Gate”克隆法構(gòu)建β-酪蛋白基因啟動子——紅色熒光蛋白(Red)報告基因表達載體pEGFP-N1-mE1-HR[18]。該載體表達框由小鼠β-酪蛋白基因啟動子調(diào)控序列和TATA box、第1外顯子、信號肽序列、Red基因和poly A 片段組成，形成一個完整的表達框，包含TALE-TFs結(jié)合位點(圖1)。

1.3 小鼠β-酪蛋白基因TALE-TFs靶點設(shè)計

由于TALEs的可編輯屬性，在目標(biāo)基因序列上幾乎可任意選擇靶序列結(jié)合位點。對于TALE-TFs構(gòu)建，可在啟動子近端區(qū)域內(nèi)選擇一段DNA序列作為靶序列，進行TALE識別模塊構(gòu)建。為有效地防止脫靶效應(yīng)，構(gòu)建TALE的靶序列不應(yīng)過短，一般建議16-30 bp。本實驗選擇長度19 bp，遵循5‘端以T堿基起始原則(圖2)。TF1對應(yīng)的RVDs排列是HD-NG-NG-NN-NN-NI-NI-NG-NG-NN-NI-NI-NN-NN-NN-NI-HD-NG;TF2對應(yīng)的RVDs排列是NN-NI-NI-NN-NN-NN-NI-HD-NG-NG-NG-NG-NG-NN-NI-NN-NG-NI-NG；TF3對應(yīng)的RVDs排列是NG-NN-NI-NN-NG-NI-NG-HD-NG-NG-NI-HD-NI-NI-NI-HD-HD-NI-HD。

圖2 小鼠β-酪蛋白基因啟動子的TALE-TFs靶點序列(方框是TATA box序列)

1.4 TALE-TFs構(gòu)建程序

實驗采用Zhang等的TALE構(gòu)建程序[9,19]。經(jīng)兩輪PCR擴增和“Golden Gate”克隆反應(yīng)構(gòu)建TALE-TFs真核表達質(zhì)粒。用AfeI酶切鑒定TALE-TFs構(gòu)建結(jié)果。

1.5 小鼠原代成纖維細胞分離和培養(yǎng)

選妊娠18 d的KM孕鼠，安樂死，取出胎鼠，采用組織塊培養(yǎng)法，培養(yǎng)液是DMEM，添加15%胎牛血清、100 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素， 37℃、5% CO2飽和濕度環(huán)境培養(yǎng)，獲得小鼠原代成纖維細胞。每隔2 d換培養(yǎng)液1次，5 d傳代1次。當(dāng)成纖維細胞覆蓋培養(yǎng)皿底部80%～90%時，進行傳代。用PBS溶液洗細胞2次，2%胰蛋白酶溶液消化細胞1～3 min。當(dāng)細胞形態(tài)變圓時，加入含血清15%的DMEM培養(yǎng)液終止細胞消化。用移液器輕輕吹吸，至培養(yǎng)皿底部的細胞完全漂浮起來。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，400 g離心10 min。保留細胞沉淀，棄去上清。加入1 mL培養(yǎng)液充分懸浮細胞，將該懸浮細胞轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)皿中，添加適量培養(yǎng)液，混勻細胞，于37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.6 質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染程序

除內(nèi)毒素的TALE-TF和pEGFP-N1-mE1-HR Red報告基因表達質(zhì)粒按1∶1質(zhì)量比混合，采用Amaxa電轉(zhuǎn)儀將質(zhì)粒導(dǎo)入小鼠成纖維細胞。培養(yǎng)成纖維細胞至90%密度，胰酶消化。1∶50倍混合Nucleofection S1和S2電轉(zhuǎn)液，100 μL電轉(zhuǎn)液混懸3×106細胞，分別加入2 μg的TALE-TF和pEGFP-N1-mE1-HR質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入電擊杯中，采用CZ-165程序?qū)嵤╇娹D(zhuǎn)染。電轉(zhuǎn)染后靜止10 min，補加800 μL培養(yǎng)液懸浮電擊杯中細胞，將細胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。電轉(zhuǎn)細胞6 h換液1次，36 h觀察細胞熒光蛋白基因表達效果。

2 結(jié)果

2.1 TALE-TFs構(gòu)建酶切檢測結(jié)果

AfeI酶切鑒定構(gòu)建的TALE-TFs真核表達質(zhì)粒。正確組裝的TALE-TFs質(zhì)粒，酶切產(chǎn)生DNA條帶大小是167、2118、3435和3544 bp，其中2118 bp的DNA片段，是18個RVD的串聯(lián)重復(fù)體(圖3)。

注：M1：Marker VII； M2：1 kb DNA ladder； TF1、TF2和TF3是AfeI酶切的人工轉(zhuǎn)錄因子；HD是AfeI酶切的pTALETF_v2 (HD) 骨架載體

AfeI酶切構(gòu)建的TALE-TF質(zhì)粒，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳運行8 min時，165 bp片段清晰可見。經(jīng)長時間電泳，各酶切片段分開后，很難看清165 bp片段。3435 bp和3544 bp條帶，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳很難分開，故TALE-TFs質(zhì)粒酶切長時間電泳可見2條DNA帶。

2.2 TALE-TFs激活pEGFP-N1-mE1-HR紅色熒光蛋白報告基因表達質(zhì)粒

細胞電轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)72 h，用Laica倒置熒光顯微鏡觀察。分別在自然光、綠色熒光和紅色熒光光源下觀察細胞發(fā)光效果，確定報告基因表達結(jié)果。圖4是TF2人工轉(zhuǎn)錄因子觀察結(jié)果，顯示出紅色熒光蛋白報告基因表達結(jié)果。TF3處理細胞組，有很弱的紅色熒光顯現(xiàn)，圖像未列出。TF1人工轉(zhuǎn)錄因子處理細胞組，未見到紅色熒光蛋白表達細胞。

比較分析同一視野下3種不同光源成像的圖片(圖4，彩插3)。由于構(gòu)建的TALE-TFs表達質(zhì)粒中含有串聯(lián)表達綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)基因，當(dāng)表達TALE-TFs蛋白時，GFP也表達。圖片b和c比較可以看到，1，2，3和其他標(biāo)注細胞呈對應(yīng)關(guān)系，這些細胞即發(fā)綠色熒光也發(fā)紅光熒光；而且部分發(fā)綠色熒光的細胞未發(fā)紅色熒光。只轉(zhuǎn)染TALE-TFs對照試驗，在紅色熒光下觀察細胞，未顯現(xiàn)熒光，是黑暗視野；只轉(zhuǎn)染β-酪蛋白基因啟動子驅(qū)動的Red基因質(zhì)粒，在紅色熒光下觀察細胞，未顯現(xiàn)紅色熒光，是黑暗視野(圖片未列出)。說明在成纖維細胞中，TALE-TFs能夠激活質(zhì)粒中β-酪蛋白基因啟動子。

3 討論

由于TALE-TFs的RVDs序列高度重復(fù)，實驗室構(gòu)建的TALE-TFs實施測序較難。根據(jù)TALE-DNA結(jié)合分子密碼，針對基因組靶位點設(shè)計TALEs，不同的TALEs具有不同的活性，可能與上下文依賴效應(yīng)或染色體狀態(tài)有關(guān)[19]。為了得到具有一定活性的TALE-TF，構(gòu)建多個TALE-TFs，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)細胞，篩選有生物學(xué)活性的TALE-TFs，能夠解決TALEs的難以測序問題和靶向局限性。本實驗針對小鼠β-酪蛋白基因啟動子序列，設(shè)計構(gòu)建了3條TALE-TFs，獲得了1條有活性的TALE-TF人工轉(zhuǎn)錄因子。在成纖維細胞中，該TALE-TF能夠激活β-酪蛋白基因啟動子，為在成纖維細胞中進行檢測β-酪蛋白基因啟動子——外源基因表達框是否能夠正常表達，提供了一條代替乳腺上皮細胞檢測系統(tǒng)的方法。

(本文圖4見彩插3。)

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