神經(jīng)氨酸酶抑制劑的研究進(jìn)展

張建國(guó)，張繼寧，黃勛娟

（1．上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海200093；2．同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海200092）

神經(jīng)氨酸酶是水解唾液酸（N－乙酰－神經(jīng)氨酸）與糖蛋白之間糖苷鍵的一種水解酶。根據(jù)糖苷鍵位置的不同可以將神經(jīng)氨酸酶分為外切酶（E3．2．1．18）和內(nèi)切酶（E3．2．1．129）。神經(jīng)氨酸酶廣泛存在于各種微生物中，并有助于微生物在動(dòng)物體表生存。1947年，神經(jīng)氨酸酶首先在純培養(yǎng)的霍亂弧菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌中被發(fā)現(xiàn)［1］，隨后，在其它70多種微生物和病毒中發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)氨酸酶；同時(shí)，在原生動(dòng)物和非致病性的微生物中也發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)氨酸酶。同一種生物中有多種神經(jīng)氨酸酶，例如粘性放線菌、脆弱擬桿菌、氣腫疽梭菌等中有水解α（2，3）－、α（2，6）－、α（2，8）－鍵的多種神經(jīng)氨酸酶［2］。哺乳動(dòng)物中有4種神經(jīng)氨酸酶 NEU1、NEU2、NEU3、NEU4［3］，隨機(jī)分布于生物的細(xì)胞器中：NEU1、NEU2、NEU3分別存在于溶酶體、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)膜上；NEU4存在于溶酶體、線粒體和細(xì)胞內(nèi)膜多個(gè)細(xì)胞器上。

早在1957年就發(fā)現(xiàn)病毒具有水解糖蛋白上糖苷鍵的能力［4］。由于研究手段的限制，1983年才確定神經(jīng)氨酸酶的晶體結(jié)構(gòu)［5］，隨后研究人員利用神經(jīng)氨酸酶和神經(jīng)氨酸的復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)確定了神經(jīng)氨酸酶的作用機(jī)理［6］：神經(jīng)氨酸酶在水解過(guò)程中和糖蛋白形成一個(gè)神經(jīng)氨酸酶陽(yáng)離子的過(guò)渡態(tài)，水分子介入后從糖蛋白中釋放出唾液酸［7］。神經(jīng)氨酸酶在病毒侵染宿主過(guò)程中有兩方面的作用：（1）病毒靠近宿主細(xì)胞時(shí)，病毒表面的神經(jīng)氨酸酶水解掉宿主細(xì)胞表面糖蛋白上的唾液酸殘基，有利于病毒核進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)；（2）子代新病毒利用神經(jīng)氨酸酶和神經(jīng)氨酸的相互作用，粘附在宿主細(xì)胞表面，等待擴(kuò)散到周圍的宿主細(xì)胞［8］。

1 神經(jīng)氨酸酶的結(jié)構(gòu)

圖1 銅綠假單胞菌神經(jīng)氨酸酶的結(jié)構(gòu)Fig．1 Structure of neuraminidase fromPseudomonas aeruginosa

神經(jīng)氨酸酶的結(jié)構(gòu)是四聚體，每個(gè)單體都含有球形的頭部和細(xì)長(zhǎng)的頸部（圖1）［9］。流感病毒可以分為A、B、C 3個(gè)亞型［10］。神經(jīng)氨酸酶以頸部固定在病毒的表面，以球形的頭部水解糖蛋白的神經(jīng)氨酸酶活性部位。分析發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)氨酸酶的活性中心是嚴(yán)格的保守區(qū)域，由10個(gè)極性氨基酸殘基和4個(gè)疏水氨基酸殘基組成，含有6個(gè)逆時(shí)針?lè)较蚺帕械摩抡郫B片。圖2是神經(jīng)氨酸酶活性中心的示意圖［11］。

圖2 神經(jīng)氨酸酶活性中心的示意圖Fig．2 The schematic diagram of neuraminidase active center

2 神經(jīng)氨酸酶的應(yīng)用

神經(jīng)氨酸酶的主要功能是幫助微生物或病毒水解糖蛋白的唾液酸殘基，被廣泛應(yīng)用于臨床疾病的診斷［2］，如治療因神經(jīng)氨酸酶缺失造成的笨拙綜合癥［1］。神經(jīng)氨酸酶水解神經(jīng)節(jié)苷酯的唾液酸殘基，形成含有不同分子數(shù)唾液酸的神經(jīng)節(jié)苷酯。其中，單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷酯（GM1）是有效治療腦神經(jīng)損傷的藥物，目前已得到廣泛應(yīng)用。

由于化學(xué)法制備GM1存在著制備效率低、產(chǎn)品不安全等不足，所以找到高效、安全的GM1制備方法就尤為重要。Peng等［12］報(bào)道了一種來(lái)源于乳酪短桿菌的神經(jīng)氨酸酶具有優(yōu)良的性質(zhì)：專一性水解神經(jīng)節(jié)苷酯生產(chǎn)GM1，效率高，水解條件溫合，過(guò)程簡(jiǎn)單。Zhang等［13］將乳酪短桿菌神經(jīng)氨酸酶基因在大腸桿菌中表達(dá)后得到更高的酶活力，為大量制備神經(jīng)氨酸酶和GM1奠定了基礎(chǔ)。由于神經(jīng)氨酸酶在病毒侵染宿主過(guò)程中的重要作用和神經(jīng)氨酸酶活性中心保守的特征，神經(jīng)氨酸酶成為神經(jīng)氨酸酶抑制劑的主要靶點(diǎn)。

3 神經(jīng)氨酸酶抑制劑的研究

3．1 神經(jīng)氨酸類似物

由于神經(jīng)氨酸酶活性中心是嚴(yán)格的保守結(jié)構(gòu)，據(jù)此設(shè)計(jì)1個(gè)與神經(jīng)氨酸酶活性中心結(jié)合的化學(xué)分子就是神經(jīng)氨酸酶抑制劑研究的總體思路［14］。神經(jīng)氨酸酶活性中心和神經(jīng)氨酸分子的相互作用已經(jīng)被解析［6］，唾液酸是設(shè)計(jì)新型神經(jīng)氨酸酶抑制劑分子的天然模板。2－脫氧－α－唾液酸及其衍生物是最先在病毒神經(jīng)氨酸酶晶體結(jié)構(gòu)解析后根據(jù)其活性中心分子作用設(shè)計(jì)的抑制劑。2－脫氧－2，3－雙脫氫－唾液酸（Neu5Ac2en）是經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)改進(jìn)之后經(jīng)體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)比較有效的1個(gè)抑制劑［15］，也是后續(xù)新抑制劑的設(shè)計(jì)模板［8］。經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)輔助軟件GRID進(jìn)一步改進(jìn)，將Neu5Ac2en的4位羥基替換為氨基或胍基后更契合神經(jīng)氨酸酶的活性中心，具有更好的抑制效果［16－17］，其中4－氨基－4－脫氧 Neu5Ac2en的抑制效果比 Neu5Ac2en的抑制效果高100倍［8］、4－胍基－4－脫氧Neu5Ac2en的抑制效果比Neu5Ac2en的抑制效果高10 000倍［18］。4－胍基－4－脫氧 Neu5Ac2en的抑制效果比4－氨基－4－脫氧Neu5Ac2en的抑制效果更好是由于它除了和Glu119發(fā)生相互作用外，還和Glu229發(fā)生相互作用；此外，這兩種抑制劑對(duì)A型和B型病毒均有抑制效果［16］。4－胍基－4－脫氧 Neu5Ac2en被葛蘭素史克命名為zanamivir，zanamivir是第一個(gè)被FDA批準(zhǔn)銷售的抗病毒藥物，目前在市場(chǎng)上作為吸入式噴霧劑銷售，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)氨酸酶通過(guò)變異對(duì)zanamivir產(chǎn)生耐藥性［19］。研究表明，唾液酸類抑制劑會(huì)保護(hù)細(xì)胞免受微生物感染引起的炎癥［20－21］。

laninamivir（圖3）是在zanamivir基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的抑制劑，是將zanamivir的2位3－羥基丙烷基團(tuán)替換為1－甲氧基－2，3－二羥基丙烷基團(tuán)形成的。laninamivir比zanamivir和環(huán)己烯類抑制劑oseltamivir具有更長(zhǎng)效的抑制效果：zanamivir和oseltamivir需要1d服用2次；而laninamivir只需1d服用1次，且服用后7d內(nèi)都有很強(qiáng)的抑制效果。laninamivir在日本已經(jīng)上市，商品名為inavir［22］。

圖3 laninamivir的分子結(jié)構(gòu)Fig．3 Molecular structure of laninamivir

3．2 環(huán)己烯類

zanamivir的研制成功促使神經(jīng)氨酸酶抑制劑的母核篩選擴(kuò)展到更大的范圍。以環(huán)己烯為母核的衍生物比神經(jīng)氨酸的氧雜環(huán)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，而且可以在原來(lái)氧分子的位置添加多種取代基更好地和神經(jīng)氨酸酶活性中心相互作用。如將zanamivir的三羥基丙烷基團(tuán)替換為脂溶性更好的烷基以利于和神經(jīng)氨酸酶的Glu276發(fā)生作用。以戊烷基作為脂溶性基團(tuán)的新化合物被命名為oseltamivir［23］，在與 Glu276結(jié)合時(shí)位置會(huì)發(fā)生調(diào)整，并且，oseltamivir和Arg224形成1個(gè)疏水區(qū)域，正好接納疏水性的戊烷基。oseltamivir對(duì)A型和B型流感病毒都有抑制效果，IC50值分別為1×10－9mol·L－1和3×10－9mol·L－1［24］。oseltamivir的乙酯形式在1999年被FDA批準(zhǔn)作為口服抗病毒藥物由Roche在市場(chǎng)上銷售，商品名為tamiflu。tamiflu在體內(nèi)被酯酶水解為oseltamivir的活性形式來(lái)發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)氨酸酶的變異也對(duì)oseltamivir產(chǎn)生耐藥性［25］。將oseltamivir 6位碳上的基團(tuán)替換為含脂肪側(cè)鏈后，IC50值降至10－11mol·L－1級(jí)別。這是因?yàn)?，脂肪?cè)鏈的疏水性、側(cè)鏈的長(zhǎng)度、手性結(jié)構(gòu)對(duì)抑制活性有很大影響［24］。將oseltamivir的醚氧基側(cè)鏈替換為含氮雜環(huán)后柔性降低［26］、替換為酰胺后極性過(guò)大，均導(dǎo)致其不能和酶活性中心很好發(fā)生作用，抑制活性降低［27］。環(huán)己烯母核上的不同位置側(cè)鏈環(huán)化形成雙環(huán)化合物，也是由于剛性太強(qiáng)，降低了和酶活性中心的有效相互作用［28］。

3．3 環(huán)戊烷類

peramivir（圖4）是以環(huán)戊烷作為母核的神經(jīng)氨酸酶抑制劑。它以zanamivir的胍基和oseltamivir的戊烷基作為支鏈，因而可以和Glu227、Glu276相互作用。體外實(shí)驗(yàn)表明peramivir抑制A型和B型病毒的IC50值分別為0．1×10－9～1．4×10－9mol、0．6×10－9～11×10－9mol［29］。BioCryst制藥公司對(duì) peramivir進(jìn)行Ⅲ期臨床研究發(fā)現(xiàn)，雖然它的口服生物利用度差，但可以有效地抑制多種流感病毒。2005年美國(guó)FDA批準(zhǔn)了peramivir注射劑的臨床試驗(yàn)。由于peramivir具有zanamivir中4位胍基和oseltamivir中6位大位阻疏水戊烷基，所以神經(jīng)氨酸酶活性位點(diǎn)的變異很難對(duì)peramivir產(chǎn)生耐藥性［30］。

圖4 peramivir的分子結(jié)構(gòu)Fig．4 Molecular structure of peramivir

3．4 苯甲酸類

苯甲酸類神經(jīng)氨酸酶抑制劑（圖5）的苯環(huán)剛性太強(qiáng)，不能和神經(jīng)氨酸酶分子的活性中心有效地契合，所以苯甲酸類化合物作為神經(jīng)氨酸酶抑制劑的活性不高［31］。目前對(duì)苯甲酸類神經(jīng)氨酸酶抑制劑的研究還停留在計(jì)算機(jī)模擬階段。

圖5 2種苯甲酸類神經(jīng)氨酸酶抑制劑的分子結(jié)構(gòu)Fig．5 Molecular structure of two analogous of benzoic acid as neuraminidase inhibitor

3．5 吡咯環(huán)類

A－525675（圖6）是含吡咯環(huán)母核的神經(jīng)氨酸酶抑制劑。也是參照神經(jīng)氨酸和神經(jīng)氨酸酶活性中心相互作用而設(shè)計(jì)的：將相當(dāng)于zanamivir 5位的N－乙?；鶊F(tuán)替換為丙烯基后，疏水性更好，有利于和Glu119、Glu227、Asp151發(fā)生相互作用［32］。利用構(gòu)效定量關(guān)系模擬吡咯環(huán)化合物和神經(jīng)氨酸酶的相互作用，發(fā)現(xiàn)氫鍵和分子間的吸引力（庫(kù)侖引力）是主要作用力［33］。目前，A－525675的合成路線也有很多種［34－35］。

圖6 A－525675的分子結(jié)構(gòu)Fig．6 Molecular structure of A－525675

3．6 吲哚生物堿類

從海洋來(lái)源的鏈霉菌中篩選出2種吲哚生物堿類化合物，它們對(duì)神經(jīng)氨酸酶的IC50值分別為67．8×10－6mol·L－1和 122．8×10－6mol·L－1［36］。siastation B是從鏈霉菌中分離到的1種具有神經(jīng)氨酸酶抑制效果的化合物，進(jìn)一步鑒定為（3S，4S，5R，6R）－6－乙酰氨基－4，5－雙脫氫哌啶－3－羧酸，該化合物具有廣譜的抑制效果。其合成路線有很多報(bào)道［37］。

3．7 多聚體

為了更好地使zanamivir發(fā)揮抑制作用，研究發(fā)現(xiàn)2個(gè)zanamivir分子連在一起的抑制效果比zanamivir單體提高100倍［8］。雖然zanamivir二聚體的生物利用度不好，但是在小鼠實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出更好的抗流感功能。zanamivir二聚體在肺中比zanamivir單體具有更長(zhǎng)的保留時(shí)間，服用7d后殘留量是zanamivir單體殘留量的100倍。目前這種zanamivir二聚體由日本Sankyo和澳大利亞Biota公司繼續(xù)研發(fā)［38］。

將zanamivir連接到多羥基聚醚鏈載體上形成的多聚體比單體具有更好的抑制效果［39］。Honda等［40］將zanamivir連接到多聚谷氨酸載體上，雖然體外抑制效果變差，但小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多聚體有利于小腸的吸收，提高了小鼠的抗病毒能力。

3．8 融合蛋白

由于病毒的不斷變異，流感病毒對(duì)oseltamivir出現(xiàn)耐藥性。DAS181是一種具有神經(jīng)氨酸酶抑制活性的融合蛋白，它含有粘性放線菌神經(jīng)氨酸酶活性中心區(qū)域和人表皮錨定蛋白的結(jié)合區(qū)域［41］，在大腸桿菌中成功融合表達(dá)。經(jīng)過(guò)純化后，對(duì)多種流感病毒有很強(qiáng)的抑制性［42］。DAS181的商品名為fludase。

3．9 多環(huán)化合物

Kirchmair等［43］通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬篩選出5個(gè)對(duì)A、B型病毒有很好抑制效果的多環(huán)化合物，它們的IC50值為0．18×10－6～17×10－6mol·L－1，其中artocarpin（圖7）可以明顯抑制3株對(duì)oseltamivir敏感的病毒，也可以抑制1株對(duì)oseltamivir不敏感的病毒。

圖7 artocarpin的分子結(jié)構(gòu)Fig．7 Molecular structure of artocarpin

4 展望

利用神經(jīng)氨酸酶的分子結(jié)構(gòu)和底物的計(jì)算機(jī)契合、預(yù)測(cè)，是目前分子藥物開(kāi)放研究的一個(gè)良好平臺(tái)，也為抑制劑的臨床試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。目前已有2種抗流感藥物投放市場(chǎng)，還有多種抑制劑處于臨床研究階段，神經(jīng)氨酸酶抑制劑的開(kāi)發(fā)范圍會(huì)越來(lái)越廣。

抑制劑和神經(jīng)氨酸酶活性中心上Glu276的相互作用依然是研究的突破點(diǎn)。神經(jīng)氨酸酶抑制劑可以和其它種類的抑制劑聯(lián)合作用，例如離子通道抑制劑［44］、三唑核苷［45］或其它抗非病毒藥物［46］。另外，篩選自然界中含有神經(jīng)氨酸酶抑制劑的微生物也是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，為神經(jīng)氨酸酶抑制劑的開(kāi)發(fā)提供了更廣闊的空間。

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