酯化法提取生物基丁二酸

葉小金，宮 莉，王紅蕾，王曉俊，徐洪章，薛冬樺

（長春工業(yè)大學化學與生命科學學院，吉林 長春130012）

丁二酸又稱琥珀酸，是一種重要的有機化合物，廣泛應用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、染料、香料、食品等領域［1－2］。工業(yè)級丁二酸主要通過化學法合成，不僅污染嚴重，而且所用原料是不可再生的石油化工產(chǎn)品［3－4］。因此，在石油資源日益枯竭的今天，環(huán)境友好的生物發(fā)酵法產(chǎn)丁二酸越來越引起重視［5－6］。

提取生物基丁二酸大多采用鈣鹽法，即在發(fā)酵液中加入鈣離子形成丁二酸鈣鹽沉淀，以達到分離丁二酸的目的，但其收率和純度并不理想［7］。絡合萃取法是通過萃取分離發(fā)酵液中丁二酸，然后反萃，獲得目標產(chǎn)物生物基丁二酸，該法污染環(huán)境，成本較高［8－9］?；诙《嵩趐H≤2、溫度為0～4℃時，溶解度降低，可通過酸結晶法析出丁二酸晶體，但收率和純度較低［10］。因此，高效分離純化發(fā)酵液中丁二酸成為研究熱點。

作者根據(jù)丁二酸鹽在有機溶劑中的溶解度，經(jīng)酸化與酯化分離純化丁二酸，擬為生物發(fā)酵法產(chǎn)丁二酸的產(chǎn)業(yè)化奠定基礎。

1 實驗

1．1 原理

生物發(fā)酵法產(chǎn)丁二酸的發(fā)酵液中，丁二酸以鹽的形式存在（微溶于醇溶劑），加酸使丁二酸鹽酸化為丁二酸與水合鹽（不溶于醇溶劑），加入醇溶劑后鹽析形成沉淀，同時丁二酸與醇溶劑發(fā)生酯化反應，溶于醇溶劑中。此酯化反應是可逆反應，將醇溶劑蒸餾除去，余下的晶體即為生物基丁二酸。反應式如下：

反應式（1）、（2）均為可逆反應，當醇過量時，反應向正反應方向進行；當醇不足時，反應向逆反應方向進行，由此達到分離純化生物基丁二酸的目的。

1．2 方法

1．2．1 丁二酸的制備

以玉米秸稈水解液為碳源，菌株Actinobacillus succinogenes X－1深層厭氧發(fā)酵獲得丁二酸發(fā)酵液，離心去除菌體，用活性炭吸附殘余色素等雜質，經(jīng)蒸餾濃縮為固體。

1．2．2 測試與表征

3）紅外光譜分析

生物基丁二酸的紅外光譜分析采用Perkin－Elmer Spectrum One型傅立葉變換紅外光譜儀。測試前，樣品在50℃下干燥24h，KBr壓片。分辨率為4cm－1，掃描范圍為4 000～450cm－1。

4）X－射線衍射（XRD）分析

采用北京普析通用型X－射線衍射儀對生物基丁二酸進行表征。Cuκα 射線，Ni片濾波，λ＝0．154 nm，掃描范圍：2θ＝15°～50°，步進掃描：Δ2θ＝4°·min－1。

5）掃描電子顯微鏡（SEM）分析

采用JSM－5600型掃描電子顯微鏡對生物基丁二酸的微觀形貌進行分析，測試電壓0～25kV，分辨率30mm。

2 結果與討論

1）濃度分析

應用Waters 600系統(tǒng)HPLC，流動相為5mmol·L－1硫酸，色譜柱為 Waters C18色譜柱（150mm×3．9mm）。利用 Waters 2487紫外檢測器進行檢測，檢測波長為210nm，進樣量為10μL，采用外標法進行定量分析。

2）丁二酸純度的測定

取一定質量（m）生物基丁二酸晶體，加入一定體積（V）水完全溶解后，測定溶液中丁二酸的濃度（c），按下式計算丁二酸純度（W）：

2．1 丁二酸二鈉在乙醇中的溶解度

在丁二酸發(fā)酵過程中，要加緩沖劑以維持內環(huán)境的pH值，達到丁二酸的持續(xù)積累［11］。但緩沖劑中含有的金屬離子以丁二酸鹽形式存在于發(fā)酵液中，影響丁二酸的分離純化。利用酸化后水合鹽不溶于醇溶劑的性質，可將金屬離子與丁二酸分離，達到純化丁二酸的目的。

不同溫度下，丁二酸二鈉在不同體積分數(shù)乙醇中的溶解度見圖1。

由圖1可知，當乙醇體積分數(shù)大于80%時，丁二酸二鈉的溶解度小于0．1g·（100g）－1，不同溫度下，丁二酸二鈉溶解度變化不大；當乙醇體積分數(shù)小于80%時，丁二酸二鈉的溶解度均顯著提高。文獻［11］報道，乙醇體積分數(shù)大于60%時，水合硫酸鈉在乙醇中的溶解度小于0．1g·（100g）－1。與以無水乙醇或水為溶劑相比，丁二酸更易溶于一定體積分數(shù)的乙醇溶劑中［12－13］。綜合考慮，當乙醇體積分數(shù)為80%時，丁二酸二鈉和水合硫酸鈉都微溶，丁二酸溶解度變大，有利于丁二酸的分離。

圖1 丁二酸二鈉在不同體積分數(shù)乙醇中的溶解度Fig．1 Solubility of Na2Succ in ethanol with different volume fractions

2．2 生物基丁二酸酯化工藝條件的優(yōu)化

通過正交實驗考察丁二酸鹽種類（A）、氫離子與丁二酸鹽的物質的量比（B）及反應時間（C）對丁二酸收率的影響，結果見表1。

表1 正交實驗結果與分析Tab．1Results and analysis of orthogonal experiment

由表1可知，各因素對生物基丁二酸收率的影響大小依次為：丁二酸鹽種類＞氫離子與丁二酸鹽的物質的量比＞反應時間。最優(yōu)的酯化工藝條件為A1B2C2，即丁二酸鹽為丁二酸二鈉、氫離子與丁二酸二鈉的物質的量比為2．2∶1、反應時間為12h，在此條件下，生物基丁二酸的收率為91．7%。

2．3 生物基丁二酸純化工藝條件的優(yōu)化

玉米秸稈水解液發(fā)酵提取的生物基丁二酸含有雜質及色素，需加活性炭進行吸附純化生物基丁二酸。在單因素實驗基礎上，利用Box－Behnken中心組合設計實驗，選定活性炭加量（A′）、脫色溫度（B′）和脫色時間（C′）3個因素為變量，各選取3個水平，目標參數(shù)為生物基丁二酸純度。

2．3．1 生物基丁二酸純化回歸模型建立及方差分析

生物基丁二酸純化工藝響應面實驗設計及結果見表2。利用Design Expert 7．0軟件對表2數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，二階響應面模型結果方差分析見表3。

表2 生物基丁二酸純化工藝響應面實驗設計及結果Tab．2 Design and results of response surface analysis of purification process of bio－based succinic acid

通常P值小于0．05為顯著［14］。由表3可知：各因素對生物基丁二酸純度影響的大小依次為：脫色時間＞脫色溫度＞活性炭加量。模型的P值小于0．0001，可見該模型為高度顯著；失擬項的F值為4．00，表明該方程的擬合效果較好；A′、B′、C′、A′2、B′2和 C′26項為高度顯著，A′B′為不顯著，其它項為顯著；失擬項P＝0．1067＞0．05，失擬檢驗結果不顯著，表明該模型與數(shù)據(jù)擬合較好，實驗誤差小，可用于生物基丁二酸純化結果的分析和預測。擬合二元多項回歸方程為：Y＝97．62＋2．85A′＋3．45B′＋3．78C′0．20A′B′－1．00A′C′－0．55B′C′－7．91A′2－6．71B′2－5．01C′2，其中Y為響應值，即生物基丁二酸純度。

表3 回歸模型方差分析Tab．3 The analysis of regression model variance

2．3．2 響應面結果與分析

三維響應面圖見圖2。

圖2 生物基丁二酸純化響應面圖Fig．2 Response surface methodology of bio－based succinic acid purification

由圖2可知，活性炭加量、脫色溫度和脫色時間對生物基丁二酸純度的影響顯著，且活性炭加量與脫色時間交互作用明顯，該模型預測的最高純度為98．9%。優(yōu)化的純化條件為：活性炭加量3．3%、脫色溫度72℃、脫色時間37min。

2．3．3 優(yōu)化純化條件驗證實驗

在優(yōu)化純化條件即活性炭加量3．3%、脫色溫度72℃、脫色時間37min下，進行5批次的生物基丁二酸純化實驗，平均純度達到98．44%，接近回歸方程預測值。表明所建立模型可反映各因素對生物基丁二酸純度的影響，純化條件可行。

2．4 不同提取方法比較

表4歸納了不同提取方法得到的生物基丁二酸的收率和純度。

表4 不同提取方法得到的生物基丁二酸的收率與純度／%Tab．4 Yield and purity of bio－based succinic acid obtained by different extraction methods／%

由表4可知，與絡合萃取法、鈣鹽法、酸結晶法比較，酯化法提取生物基丁二酸的效果較好。

2．5 生物基丁二酸的表征

以色譜純丁二酸為標樣，對生物基丁二酸進行紅外表征，結果見圖3。

圖3 丁二酸標樣（a）和生物基丁二酸（b）的紅外光譜Fig．3 IR Spectra of succinic acid standard sample（a），bio－based succinic acid（b）

由圖3可知：2 400～3 300cm－1處有寬吸收帶，1 419cm－1處有較強吸收，說明存在－COOH；1 694 cm－1處為 C＝O伸縮振動吸收，1 207cm－1和1 310 cm－1處分別為C－O伸縮振動和O－H面內變形振動吸收，1 630～1 680cm－1處沒有吸收，說明不存在C＝C鍵；生物基丁二酸與色譜純丁二酸的吸收峰吻合，具有相同的基團，表明提取產(chǎn)物確為生物基丁二酸。

為進一步表征生物基丁二酸的晶體結構，對其進行X－射線衍射分析，結果見圖4。

圖4 丁二酸標樣（a）和生物基丁二酸（b）的XRD圖譜Fig．4 XRD Patterns of succinic acid standard sample（a），bio－based succinic acid（b）

由圖4可知，與標樣相比，生物基丁二酸在2θ為19．9°、26．0°和31．4°處具有相同的晶體特征峰。說明酯化法提取的生物基丁二酸與標樣有相同的晶型。

2．6 生物基丁二酸的微觀形貌

利用掃描電子顯微鏡觀察生物基丁二酸的微觀形貌，見圖5。

圖5 生物基丁二酸的掃描電子顯微鏡照片F(xiàn)ig．5 The SEM images of bio－based succinic acid

由圖5可知，與標樣相比，酯化法得到的生物基丁二酸晶體在微觀形貌上不規(guī)則，晶體形狀各異，可能是酯化過程中其它物質與丁二酸之間的相互作用力改變了生物基丁二酸晶體的外貌形狀［10］。與未純化生物基丁二酸相比，純化后的生物基丁二酸晶形更不規(guī)則，可能是因為結晶溫度導致生物基丁二酸的微觀形貌發(fā)生了進一步的改變［17］。

3 結論

（1）80%乙醇中，丁二酸二鈉和水合硫酸鈉微溶、丁二酸溶解度較大，有利于丁二酸的分離純化。

（2）正交實驗優(yōu)化的酯化條件為：丁二酸鹽為丁二酸二鈉、氫離子與丁二酸二鈉的物質的量比為2．2∶1、反應時間為12h，在此條件下，生物基丁二酸收率為91．7%。Box－Behnken中心組合設計實驗優(yōu)化的純化工藝為：活性炭加量3．3%、脫色溫度72℃、脫色時間37min，在此條件下，生物基丁二酸純度達到98．44%。

（3）通過紅外光譜和X－射線衍射分析確證所提取的物質為生物基丁二酸，與丁二酸標樣具有相同的晶體特征峰。通過掃描電子顯微鏡觀察可知，提取條件對丁二酸的微觀形貌有影響。

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