兩種雙水相體系提取枇杷葉中黃酮的工藝研究

王 麗，費(fèi)春芳

（常州工學(xué)院理學(xué)院，江蘇 常州213022）

枇杷葉是傳統(tǒng)中草藥。目前從枇杷葉中分離的有效成分主要有揮發(fā)油、三萜酸類、倍半萜類、黃酮類、多酚類、有機(jī)酸類等[1－3］。從枇杷葉中提取黃酮的方法主要有：水浸提取法[4］、乙醇提取法[5］、超聲波提取法[6］、微波輔助萃取法[7］等。由于雙水相萃取技術(shù)[8］避免了有毒試劑的使用，能夠提供溫和的水環(huán)境，具有活性損失小等特點(diǎn)，因此，作者在此研究了聚乙二醇－硫酸銨和乙醇－硫酸銨兩種雙水相體系提取枇杷葉中黃酮的工藝過程，優(yōu)化了提取工藝條件，并比較了兩種體系的提取效率。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

枇杷葉采摘于常州工學(xué)院新北校區(qū)。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，聚乙二醇2000，十二烷基苯磺酸鈉（SDBS），十四烷基三甲基氯化銨（≥99%），硫酸銨，正丁醇，無水乙醇，氫氧化鈉，硝酸鋁，亞硝酸鈉，均為分析純。

TU－1901型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FA1004B型電子天平，上海超平科學(xué)儀器有限公司；SK2210LHC型超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；TDL80型臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；F80型高速粉碎機(jī)，江蘇金壇金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；恒溫水浴加熱器，江蘇金壇榮華儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 枇杷葉處理

取新鮮的枇杷葉，洗凈，于60℃烘箱中烘2h，用高速粉碎機(jī)粉碎，保存于試劑瓶中，待用。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別 量 取 1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00 mL、5.00mL、6.00mL、7.00mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液置于7個(gè)25mL容量瓶（編號(hào)1?！?＃）中，加入1.00mL 5%NaNO2溶液，輕輕搖勻，放置6min；加入1.00 mL 10%Al（NO3）3溶液，輕輕搖勻，放置6min；加入3.00mL 4%NaOH溶液，加水稀釋至刻度，搖勻，放置15min；取6＃容量瓶，用紫外可見分光光度計(jì)掃描其波長(zhǎng)，然后在最大波長(zhǎng)下，以空白試劑作參比，測(cè)7組溶液的吸光度，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

本實(shí)驗(yàn)以E值（溶液的吸光度乘以稀釋倍數(shù)和原液的體積后，除以原料的質(zhì)量，正比于提取效率）表示提取效率，進(jìn)行提取工藝的優(yōu)化及提取效率的比較。

1.2.3 黃酮提取及含量測(cè)定

聚乙二醇－硫酸銨體系：取25mL比色管，加入2.0g聚乙二醇、1.5g硫酸銨、0.3g枇杷葉粉、pH 值為9的緩沖溶液至10.0mL，于40℃提取1.5h，取上層清液，按黃酮的亞硝酸鈉－硝酸鋁－氫氧化鈉檢測(cè)法[9］處理，于497.5nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算E值。

乙醇－硫酸銨體系：取25mL比色管，加入4.0mL無水乙醇、1.8g硫酸銨、0.2g枇杷葉粉、去離子水至10.0mL，于40℃提取1.0h。取上層清液，同法處理，于波長(zhǎng)497.5nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算E值。

2 結(jié)果與討論

2.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定

按1.2.2方法用紫外可見分光光度計(jì)掃描，確定蘆丁的最大吸收波長(zhǎng)為497.5nm。

2.2 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）

圖1 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of rutin

由圖1可知，蘆丁濃度與吸光度的線性關(guān)系良好。

2.3 聚乙二醇－硫酸銨體系中各因素對(duì)黃酮提取效率的影響

2.3.1 聚乙二醇用量對(duì)提取效率的影響

在聚乙二醇－硫酸銨體系中分別加入不同量（1.5 g、2.0g、2.5g、3.0g、3.5g）的聚乙二醇，然后加入1.5g硫酸銨、0.3g枇杷葉粉、pH值為9的緩沖溶液至10.0mL，于40℃提取1.5h，測(cè)定吸光度，考察聚乙二醇用量對(duì)提取效率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 聚乙二醇用量對(duì)提取效率的影響Fig.2 Effect of the amount of PEG on extraction efficiency

由圖2可知，聚乙二醇用量為2.0g時(shí)，E值最大，提取效率最高。因此，選取聚乙二醇用量為2.0g。

2.3.2 硫酸銨用量對(duì)提取效率的影響

在聚乙二醇－硫酸銨體系中加入2.0g聚乙二醇、不同量（1.0g、1.5g、2.0g、2.5g、3.0g）的硫酸銨，然后加入0.3g枇杷葉粉、pH值為9的緩沖溶液至10.0mL，于40℃提取1.5h，測(cè)定吸光度，考察硫酸銨用量對(duì)提取效率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 硫酸銨用量對(duì)提取效率的影響Fig.3 Effect of the amount of ammonium sulfate on extraction efficiency

由圖3可知，硫酸銨用量為1.5g時(shí)，E值最大，提取效率最高。因此，選取硫酸銨用量為1.5g。

2.3.3 pH值對(duì)提取效率的影響

在聚乙二醇－硫酸銨體系中加入2.0g聚乙二醇、1.5g硫酸銨、0.3g枇杷葉粉、不同pH 值（7、8、9、10、11）的緩沖溶液，于40℃提取1.5h，測(cè)定吸光度，考察pH值對(duì)提取效率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 pH值對(duì)提取效率的影響Fig.4 Effect of the pH value on extraction efficiency

由圖4可知，緩沖溶液的pH值為9時(shí)，E值最大，提取效率最高。因此，選取緩沖溶液的pH值為9。>

2.3.4 料液比對(duì)提取效率的影響

在聚乙二醇－硫酸銨體系中加入2.0g聚乙二醇、1.5g硫酸銨、不同量（0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5 g）的枇杷葉粉、pH值為9的緩沖溶液至10.0mL，使料液比（g∶mL，下同）分別為0.1∶10、0.2∶10、0.3∶10、0.4∶10、0.5∶10，于40℃提取1.5h，測(cè)定吸光度，考察料液比對(duì)提取效率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 料液比對(duì)提取效率的影響Fig.5 Effect of the solid－liquid ratio on extraction efficiency

由圖5可知，料液比為0.3∶10時(shí)，E值最大，提取效率最高。因此，選取料液比為0.3∶10。

2.3.5 提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響

在聚乙二醇－硫酸銨體系中加入2.0g聚乙二醇、1.5g硫酸銨、0.3g枇杷葉粉、pH值為9的緩沖溶液至10.0mL，于40 ℃分別提取不同時(shí)間（0.5h、1.0 h、1.5h、2.0h、2.5h），測(cè)定吸光度，考察提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響Fig.6 Effect of the extraction time on extraction efficiency

由圖6可知，提取時(shí)間為1.5h時(shí)，E值最大，提取效率最高。因此，選取提取時(shí)間為1.5h。

2.3.6 提取溫度對(duì)提取效率的影響

在聚乙二醇－硫酸銨體系中加入2.0g聚乙二醇、1.5g硫酸銨、0.3g枇杷葉粉、pH值為9的緩沖溶液至10.0mL，分別在不同溫度（20 ℃、30 ℃、40 ℃、50℃、60℃）下提取1.5h，測(cè)定吸光度，考察提取溫度對(duì)提取效率的影響，結(jié)果見圖7。

由圖7可知，提取溫度為40℃時(shí)，E值最大，提取效率最高。因此，選取提取溫度為40℃。

2.4 乙醇－硫酸銨體系中各因素對(duì)黃酮提取效率的影響

2.4.1 無水乙醇用量對(duì)提取效率的影響

圖7 提取溫度對(duì)提取效率的影響Fig.7 Effect of the extraction temperature on extraction efficiency

在乙醇－硫酸銨體系中加入不同量（3.0mL、3.5 mL、4.0mL、4.5mL、5.0mL）的無水乙醇、1.8g硫酸銨、0.2g枇杷葉粉、去離子水至10.0mL，于40℃提取1.0h，測(cè)定吸光度，考察無水乙醇用量對(duì)提取效率的影響，結(jié)果見圖8。

圖8 無水乙醇用量對(duì)提取效率的影響Fig.8 Effect of the amount of anhydrous ethanol on extraction efficiency

由圖8可知，當(dāng)無水乙醇用量為4.0mL時(shí)，E值最大，提取效率最高。因此，選取無水乙醇用量為4.0 mL。

2.4.2 硫酸銨用量對(duì)提取效率的影響

在乙醇－硫酸銨體系中分別加入不同量（1.5g、1.8g、2.1g、2.4g、2.7g）的硫酸銨、4.0mL無水乙醇、0.2g枇杷葉粉、去離子水至10.0mL，于40℃提取1.0h，測(cè)定吸光度，考察硫酸銨用量對(duì)提取效率的影響，結(jié)果見圖9。

由圖9可知，當(dāng)硫酸銨用量為1.8g時(shí)，E值最大，提取效率最高。因此，選取硫酸銨用量為1.8g。

2.4.3 料液比對(duì)提取效率的影響

在乙醇－硫酸銨體系中加入1.8g硫酸銨、4.0mL無水乙醇、不同量（0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5g）的枇杷葉粉、去離子水至10.0mL，使料液比分別為0.1∶10、0.2∶10、0.3∶10、0.4∶10、0.5∶10，于40℃提取1.0h，測(cè)定吸光度，考察料液比對(duì)提取效率的影響，結(jié)果見圖10。

圖9 硫酸銨用量對(duì)提取效率的影響Fig.9 Effect of the amount of ammonium sulfate on extraction efficiency

圖10 料液比對(duì)提取效率的影響Fig.10 Effect of the solid－liquid ratio on extraction efficiency

由圖10可知，當(dāng)料液比為0.2∶10時(shí)，E值最大，提取效率最高。因此，選取料液比為0.2∶10，即枇杷葉粉用量為0.2g。

2.4.4 提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響

在乙醇－硫酸銨體系中加入1.8g硫酸銨、4.0mL無水乙醇、0.2g枇杷葉粉、去離子水至10.0mL，于40℃分別提取不同時(shí)間（0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h），測(cè)定吸光度，考察提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響，結(jié)果見圖11。

圖11 提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響Fig.11 Effect of the extraction time on extraction efficiency

由圖11可知，提取時(shí)間為1.0h時(shí)，E值最大，提取效率最高。因此，選取提取時(shí)間為1.0h。

2.4.5 提取溫度對(duì)提取效率的影響

在乙醇－硫酸銨體系中加入1.8g硫酸銨、4.0mL無水乙醇、0.2g枇杷葉粉、去離子水至10.0mL，分別于不同溫度（20℃、30℃、40℃、50℃、60℃）下提取1.0h，測(cè)定吸光度，考察提取溫度對(duì)提取效率的影響，結(jié)果見圖12。

圖12 提取溫度對(duì)提取效率的影響Fig.12 Effect of the extraction temperature on extraction efficiency

由圖12可知，提取溫度為40℃時(shí)，E值最大，提取效率最高。因此，選取提取溫度為40℃。

2.5 兩種體系的提取效果比較（表1 ）

表1 兩種體系提取枇杷葉中黃酮的效果（n＝3）Tab.1 Extraction efficiency of flavonoids from loquat leaves in the two systems（n＝3）

由表1 可知，乙醇－硫酸銨體系中的黃酮提取效率要優(yōu)于聚乙二醇－硫酸銨體系。

3 結(jié)論

以枇杷葉為原料，利用雙水相體系提取黃酮。結(jié)果表明：聚乙二醇－硫酸銨體系中，在聚乙二醇用量為2.0g、硫酸銨用量為1.5g、料液比為0.3∶10、pH 值為9、提取溫度為40℃、提取時(shí)間為1.5h的條件下，提取效率最高，達(dá)5.80%；乙醇－硫酸銨體系中，在無水乙醇用量為4.0mL、硫酸銨用量為1.8g、料液比為0.2∶10、提取溫度為40℃、提取時(shí)間為1.0h的條件下，提取效率最高，達(dá)7.49%。該方法具有操作簡(jiǎn)便、條件溫和、設(shè)備簡(jiǎn)單、成本較低、效率較高的優(yōu)點(diǎn)，為枇杷葉的開發(fā)利用提供了較好的參考依據(jù)。

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