長爪沙鼠的生物凈化技術(shù)

盧領(lǐng)群，宋曉明，戴方偉，周莎桑，李長龍, 馬偉鋒，柯賢福，樓 琦，呂 宇，薩曉嬰

(1.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗動物中心, 杭州 310013;2.杭州師范大學(xué)實(shí)驗動物中心, 杭州 310036；3.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗動物學(xué)系，北京 100069)

長爪沙鼠(Merionesunguiculatus)屬于嚙齒目、沙鼠屬(Gerbillus)動物。野生型沙鼠主要分布在我國西北、華北及蒙古的干旱和半干旱地區(qū)的草原地帶。1935年由日本人開始馴化和實(shí)驗動物化，轉(zhuǎn)而由Schwentker引入美國、英國和法國等國家[1]，于20世紀(jì)60年代開始作為實(shí)驗動物應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究。長爪沙鼠具有許多特殊的生物學(xué)特性，可作為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的動物模型，被稱為“多能性”的實(shí)驗動物[2]。目前國內(nèi)有兩個主要的長爪沙鼠群體，分別保存于浙江省實(shí)驗動物中心(命名為Z:ZCLA)和首都醫(yī)科大學(xué)[1]，其中的Z:ZCLA長爪沙鼠種群經(jīng)48代選育，已育成一個生物學(xué)性能穩(wěn)定的普通級長爪沙鼠新品系。為適應(yīng)國家對我國特色品系實(shí)驗動物化的整體要求，促進(jìn)長爪沙鼠品系的應(yīng)用和國內(nèi)特色資源的保種，我們對該長爪沙鼠群體實(shí)施微生物質(zhì)量升級和實(shí)驗動物化。由于采用精子體外受精技術(shù)實(shí)現(xiàn)生物凈化客觀上缺乏合適的受體鼠，我們選擇剖腹摘宮技術(shù)對長爪沙鼠進(jìn)行生物凈化，該技術(shù)在實(shí)驗動物的微生物凈化、無菌動物的繁育等方面應(yīng)用普遍[3]。因長爪沙鼠的特殊性，整個生物凈化過程需克服孕鼠選擇和臨產(chǎn)期判斷、無菌剖宮產(chǎn)、仔鼠代乳等諸方面的技術(shù)難關(guān)，本文就上述過程進(jìn)行簡要匯總，以期為我國其他特色實(shí)驗動物資源的實(shí)驗動物化提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗動物

普通級Z:ZCLA長爪沙鼠和清潔級ICR小鼠、SD大鼠均由浙江省實(shí)驗動物中心提供，使用許可證號：SYXK(浙)2008-0114、SYXK(浙)2008-0113，獨(dú)立通風(fēng)籠盒環(huán)境中飼育，清潔級長爪沙鼠由上述普通級長爪沙鼠經(jīng)生物凈化建立。

1.2 實(shí)驗材料

獨(dú)立通風(fēng)籠盒(IVC)，蘇杭公司生產(chǎn)；超凈工作臺由蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)。一般物品包括：乳膠手套、油汀、溫度計、量筒、滅菌蒸餾水、質(zhì)量百分濃度為2% 過氧乙酸消毒液(臨用前用35℃ 的蒸餾水配制)、質(zhì)量百分濃度5 % NaOH堿液；手術(shù)用物品包括：鑷子(15 cm規(guī)格)2把，眼科鑷2把，手術(shù)刀1把，手術(shù)剪2把，脫脂棉，紗布，止血鉗4～5把，以上手術(shù)器具需經(jīng)121℃5磅高壓蒸汽滅菌20 min。

鼠飼料為輻照繁殖料，由浙江省實(shí)驗動物飼料生產(chǎn)基地提供，質(zhì)量規(guī)格：φ12 mm 顆粒。兔乳為泌乳期母兔分泌的乳汁，經(jīng)高壓蒸汽(115℃，15 min)滅菌后備用。輔料的制備：將鼠飼料碾碎成粉末，置無菌瓶皿中，添加滅菌后的兔乳，充分?jǐn)嚢杌靹蛑吝m當(dāng)濕度即可。

1.3 長爪沙鼠孕鼠選擇和臨產(chǎn)期判斷

選擇3月齡普通級長爪沙鼠，按雌雄比1:1同居交配。通過①觀察法：觀察分娩前孕鼠躁動不安、清理產(chǎn)床，孕鼠下腹部膨大、外陰濕潤鮮紅且陰道口擴(kuò)大，待孕鼠俯臥巢內(nèi)并見流血和羊水后表明即將分娩；②觸診法：安靜自然保定分娩期孕鼠，通過觸摸其腹部，對比感覺腹肌松弛度，胎仔頭硬度，胎仔頭和軀干大小。當(dāng)胎仔頭和軀干大小一致(寬度達(dá)到約0.8～1.2 cm)，腹肌松弛，胎仔頭較硬時，則孕鼠分娩時機(jī)成熟。在此基礎(chǔ)上，提前(2～3)h對孕鼠肌內(nèi)注射適當(dāng)劑量的黃體酮，并于注射后(12～24)h內(nèi)施行剖宮產(chǎn)手術(shù)。須注意每只動物黃體酮注射總劑量不超過6 mg，次數(shù)不超過3次。

1.4 剖宮產(chǎn)手術(shù)

整個手術(shù)應(yīng)無菌操作。采用頸椎脫臼法處死孕鼠后，迅速將其浸入質(zhì)量百分濃度為2% 過氧乙酸消毒液5 s，置于手術(shù)臺，固定四肢。消毒孕鼠腹部，用滅菌剪打開腹腔，暴露子宮。用止血鉗夾住兩側(cè)輸卵管前側(cè)和子宮遠(yuǎn)端(圖1)，從遠(yuǎn)端迅速切斷子宮。切取子宮后，將其連同止血鉗迅速放入35℃消毒液中浸泡約10 s。立即以質(zhì)量百分濃度5% NaOH堿液(溶劑為水)中和消毒液，蒸餾水沖洗后，紗布吸干。迅速撕開子宮，破羊膜取出胎仔，紗布或棉簽去除羊水，擦凈胎盤和胎仔，特別是胎仔口鼻處。以濕棉簽輕輕按摩胎仔胸部，刺激其獲得自主呼吸，全過程需保溫，直至胎仔全身鮮紅，扭曲臍帶，并用紗布扯斷臍帶壓迫止血。自主呼吸的仔鼠體色由紫紅逐漸轉(zhuǎn)成鮮紅色，約半小時后即可授乳或代乳。

圖1 止血鉗夾住子宮示意圖

1.5 選擇母鼠代乳

分別選取自然分娩第1天的長爪沙鼠、ICR小鼠和SD大鼠作為代乳母鼠，每種代乳母鼠取8只，每只代乳6只新生長爪沙鼠。所有代乳母鼠、仔長爪沙鼠的飲水、飼料等飼養(yǎng)環(huán)境均保持一致，每天記錄窩重和每窩存活數(shù)，連續(xù)記錄25 d，比較三種動物代乳的仔長爪沙鼠的生長曲線和存活率。

另設(shè)四組：ICR泌乳小鼠單純代乳剖宮產(chǎn)仔長爪沙鼠組、ICR泌乳小鼠代乳配合輔料飼養(yǎng)剖宮產(chǎn)仔長爪沙鼠組、ICR小鼠代乳自然分娩仔長爪沙鼠組和親母鼠哺乳組。選擇清潔級ICR泌乳小鼠作為仔長爪沙鼠的代乳母鼠提供母乳，于17日齡時增設(shè)輔料添加組，即含67%(v/w，mL兔乳/100 g小鼠飼料粉末)兔乳的鼠飼料粉末，每天按5 g/只的兔乳量添加兩次。代乳期間每3 d更換1次墊料。每組選7窩剖宮產(chǎn)仔長爪沙鼠，每窩留6只，每天記錄窩重和每窩存活數(shù)，連續(xù)記錄25 d，比較四組仔鼠生長情況。

圖2 長爪沙鼠、ICR小鼠和SD大鼠代乳的自然分娩仔長爪沙鼠每窩存活率趨勢圖

2 結(jié)果

2.1 長爪沙鼠、ICR小鼠和SD大鼠代乳自然分娩的仔長爪沙鼠生長情況比較結(jié)果

SD大鼠代乳的長爪沙鼠在3日齡時開始出現(xiàn)顯著性死亡，存活率降至80%以下，到11日齡，仔鼠存活率降至47%，在17日齡有2窩仔鼠整體淘汰。仔鼠25日齡時，存活率僅為31%。在整個代乳期，仔鼠均存在陸續(xù)死亡現(xiàn)象。ICR小鼠代乳的48只仔鼠中，有46只存活，25日齡時存活率為95%。長爪沙鼠代乳的仔鼠中，僅一組動物出現(xiàn)3只死亡，其余45只均存活，見圖2。

通過比較各組仔鼠平均體重(圖3)，我們發(fā)現(xiàn)ICR小鼠代乳的仔鼠平均體重在20日齡前略高于長爪沙鼠代乳和SD大鼠代乳的長爪沙鼠，個別日齡存在顯著性差異，表明ICR小鼠代乳的長爪沙鼠生長發(fā)育情況較為理想。在20日齡后，與長爪沙鼠代乳的仔鼠比較，ICR小鼠代乳動物體重增重明顯變緩，這可能與ICR小鼠哺乳周期有關(guān)。SD大鼠代乳的仔鼠體重變化存在較為明顯的組內(nèi)波動。綜合上述結(jié)果，我們選擇了ICR小鼠作為長爪沙鼠生物凈化后的代乳母鼠。

2.2 剖宮產(chǎn)及代乳情況

共實(shí)施長爪沙鼠生物凈化85胎次，通過ICR小鼠代乳并成功斷乳167只，胎仔平均出生體重2.9 g/只，窩平均胎仔數(shù)8.4只/窩，共完成20只通過生物凈化后代乳與自然分娩后母乳喂養(yǎng)的長爪沙鼠生長曲線比較(圖4)。與母乳喂養(yǎng)的長爪沙鼠相比，生物凈化后的代乳沙鼠體重普遍較低，從1日齡到25日齡均有統(tǒng)計學(xué)差異。

由圖5可知，剖宮產(chǎn)仔長爪沙鼠的生長曲線普遍低于自然分娩組，提示剖宮產(chǎn)手術(shù)對仔長爪沙鼠的生長發(fā)育帶來較大影響，添加輔料組可顯著提高17日齡后剖宮產(chǎn)仔長爪沙鼠的體重增長速度，并于斷奶前達(dá)到優(yōu)于ICR小鼠代乳自然分娩仔長爪沙鼠組的體重水平，表明所添輔料有助于剖宮產(chǎn)手術(shù)中的仔長爪沙鼠實(shí)現(xiàn)正常離乳。

圖3 長爪沙鼠、ICR小鼠和SD大鼠代乳自然分娩仔代長爪沙鼠的生長曲線比較

圖4 通過生物凈化后代乳與自然分娩后母乳喂養(yǎng)的長爪沙鼠生長曲線比較

圖5 剖宮產(chǎn)仔長爪沙鼠由ICR小鼠單純代乳與配合輔料飼養(yǎng)、自然分娩仔長爪沙鼠由ICR小鼠代乳和由親母鼠代乳的生長曲線比較

3 討論

3.1 長爪沙鼠孕鼠選擇和臨產(chǎn)期判斷

與大、小鼠不同，長爪沙鼠是“一夫一妻”長期同居的繁殖方式，因此選擇3月齡普通級長爪沙鼠進(jìn)行雌雄比1∶1同居交配。小鼠的妊娠期為19～21 d，長爪沙鼠妊娠期24 d～26 d，代乳ICR小鼠的交配時間較剖宮產(chǎn)母鼠遲3 d～4 d，即ICR代乳母鼠在剖宮產(chǎn)手術(shù)前12～36 h內(nèi)分娩。由于長爪沙鼠雌鼠在受精后難發(fā)現(xiàn)陰栓，其預(yù)產(chǎn)期僅能依靠計算雌雄同居時間，結(jié)合觀察法、觸診法等[4]綜合方法來判定孕鼠分娩時間點(diǎn)，以把握最佳剖宮產(chǎn)時機(jī)，因此這對實(shí)驗人員判斷沙鼠臨產(chǎn)期的經(jīng)驗要求較高。

3.2 黃體酮在長爪沙鼠剖腹取胎中的應(yīng)用

根據(jù)胚胎發(fā)育的原理[5]，嚙齒類實(shí)驗動物在接近出生前的24 h內(nèi)生長發(fā)育最旺盛，仔鼠初生時20%體重都是在最后24 h內(nèi)生長的，提早幾個小時進(jìn)行剖宮產(chǎn)會對胎兒的成熟造成很大影響。為了避免判斷錯誤，確保胎鼠發(fā)育完全，在前述診斷基礎(chǔ)上，提前2 h～3 h對孕長爪沙鼠肌注適當(dāng)劑量的黃體酮[6]，使子宮松弛，收縮力下降，以推遲孕鼠的分娩時間。動物可于注射后12 h～24 h內(nèi)施行剖宮產(chǎn)術(shù)，注意給藥次數(shù)不宜過多(總劑量≤6 mg，次數(shù)≤3次)，否則易導(dǎo)致剖宮產(chǎn)仔鼠發(fā)黑，過于成熟，甚至出現(xiàn)死胎現(xiàn)象。

3.3 無菌剖腹摘宮技術(shù)

剖宮產(chǎn)手術(shù)是實(shí)現(xiàn)生物凈化的有效途徑，可有效防止病原體通過胎盤屏障引起子代的垂直感染。為確保剖宮產(chǎn)手術(shù)的無菌狀態(tài)，應(yīng)注意所有與手術(shù)有關(guān)的物品必須無菌，手術(shù)中嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，注意保溫，新生幼仔的剖宮取胎中手術(shù)臺環(huán)境溫度一般控制在(30～33)℃左右。并對子宮和胎盤進(jìn)行微生物檢驗，一旦發(fā)現(xiàn)污染，馬上棄除該批幼仔。手術(shù)應(yīng)以快為原則，全過程須在10 min～15 min內(nèi)完成，操作準(zhǔn)確、熟練，否則會影響新生鼠的成活率。

3.4 代乳母鼠的選擇

選擇經(jīng)產(chǎn)、母性好的清潔級雌鼠為剖宮產(chǎn)長爪沙鼠的代乳母鼠。當(dāng)確定乳母鼠懷孕后，將雄鼠移出，以免再生產(chǎn)，影響帶乳。本研究分別選用SD大鼠、ICR小鼠和普通級長爪沙鼠三種代乳母鼠進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)SD大鼠的產(chǎn)乳量多，產(chǎn)乳周期短，仔鼠存活率低。長爪沙鼠產(chǎn)乳量和產(chǎn)乳周期雖更符合被乳仔鼠生長需求，但現(xiàn)只有普通級種群，不適合作凈化仔鼠代乳鼠。ICR小鼠易獲得，產(chǎn)乳周期較長，性情溫順，故選擇母性良好的清潔級ICR小鼠作為凈化長爪沙鼠的代乳母鼠。

3.5 提高仔長爪沙鼠代乳成活率方法的探索

在代乳母鼠和仔鼠初次接觸時，采用合理的染味、觀察等方法可提高代乳成功率。代乳技術(shù)建立前期，以生產(chǎn)或剛生產(chǎn)完的清潔級ICR泌乳小鼠作為代乳母鼠，發(fā)現(xiàn)長爪沙鼠剖腹取胎當(dāng)日及2 d內(nèi)仔長爪沙鼠成活率最低。故將產(chǎn)前2 d～3 d的乳母鼠轉(zhuǎn)移到凈化室適應(yīng)環(huán)境，并停止更換墊料，在其產(chǎn)后第一天是導(dǎo)入被乳仔鼠的最佳時間。乳母鼠初次接觸代乳時，預(yù)留親仔1～2只，將仔長爪沙鼠與籠內(nèi)墊料輕柔地混翻，以確保其充分染味，混養(yǎng)數(shù)小時后，若發(fā)現(xiàn)仔長爪沙鼠的腹部有白色乳液，表明授乳成功，即可將母鼠親仔取出。

剖宮產(chǎn)的長爪沙鼠生長不穩(wěn)定，每窩仔鼠離乳體重不一致，20日齡后體重呈明顯下降趨勢，并出現(xiàn)一定數(shù)量的死亡。試驗發(fā)現(xiàn)在仔鼠17～20日齡時開始添加輔料，每100 g鼠飼料粉末中含兔乳60 mL～70 mL，每天2～5次，視仔鼠的健康及消化情況適當(dāng)增減，直至仔鼠日體重明顯上升即可考慮斷奶，一般在25～30日齡，體重達(dá)16 g后安全離乳。采用添加輔料法有助于剖宮產(chǎn)的仔長爪沙鼠實(shí)現(xiàn)正常離乳，并優(yōu)于代乳自然分娩仔長爪沙鼠的體重水平。

3.6 IVC內(nèi)飼養(yǎng)環(huán)境控制

長爪沙鼠生性好動，墊料消耗大，且易臟。無菌草紙[7]作為墊料，易被叼于一處，造成IVC籠盒內(nèi)氣流不暢。無菌木屑較為常用，更適于新生鼠代乳期，因產(chǎn)粉塵多，需勤更換。使用玉米芯作為墊料，可以明顯改善籠盒內(nèi)環(huán)境。新生幼仔的環(huán)境溫度一般控制在30℃～33℃左右，5 d后降至24℃～27℃左右，濕度40%～70%。

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