兩種抗凝劑對(duì)實(shí)驗(yàn)用小型豬血液生理指標(biāo)的影響

王 洪，魏 杰，王吉星，李芳芳，岳秉飛

(1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行業(yè)協(xié)會(huì)，北京 100195)

小型豬是近年來生物醫(yī)學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛的非嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，在解剖學(xué)、生理學(xué)、疾病發(fā)生機(jī)理等方面與人相似性極高，具有其它實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不可替代的優(yōu)越性[1-3]。小型豬和人的各器官系統(tǒng)不僅在形態(tài)上相似而且生理學(xué)功能也基本相同，特別是皮膚、心血管系統(tǒng)、胃腸道和泌尿系統(tǒng)尤其如此，因此在生物醫(yī)學(xué)研究中，小型豬越來越多地被用來替代犬、猴等非嚙齒類動(dòng)物，小型豬更適合用于毒理實(shí)驗(yàn)。小型豬是替代傳統(tǒng)非嚙齒類犬和猴的理想動(dòng)物，將會(huì)在未來生物醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮日益重要的作用，而建立小型豬的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)庫具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義[4，5]。我國小型豬種質(zhì)資源豐富，品種多樣，遺傳穩(wěn)定，具有體型小、易于飼養(yǎng)和操作等優(yōu)點(diǎn)，近年來小型豬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化進(jìn)程不斷進(jìn)展[6]。目前，已進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化的品種有西藏小型豬，廣西巴馬小型豬，貴州小型豬，滇南小耳豬，五指山小型豬，版納微型豬，中國農(nóng)大小型豬等[7]。

血液生理、生化指標(biāo)檢測(cè)及相關(guān)生物特性的研究是實(shí)驗(yàn)用小型豬標(biāo)準(zhǔn)化研究的基本內(nèi)容，也是病理、生理以及毒理學(xué)研究工作的重要基礎(chǔ)指標(biāo)和判定小型豬生理狀態(tài)的重要依據(jù)。[5]抗凝劑是在臨床和科學(xué)研究中經(jīng)常使用的化學(xué)藥劑。在血液細(xì)胞計(jì)數(shù)過程中，需要對(duì)血液進(jìn)行抗凝處理。常用的抗凝劑有肝素鈉、EDTA鹽、檸檬酸鹽等[8]。

目前國內(nèi)對(duì)于抗凝劑對(duì)實(shí)驗(yàn)用小型豬血液生理指標(biāo)影響的報(bào)道極少，本研究中的房山封閉群小型豬來源于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)培育的中國實(shí)驗(yàn)用小型豬，引種后在北京房山區(qū)豬場(chǎng)按照封閉群繁育標(biāo)準(zhǔn)繁殖20多年。本研究探討了抗凝劑對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)，血紅蛋白含量和血小板含量等22項(xiàng)血液學(xué)生理指標(biāo)的影響，并對(duì)使用不同抗凝劑得到的測(cè)定值進(jìn)行比較分析，旨在為實(shí)驗(yàn)用小型豬建群，疾病動(dòng)物模型篩選和器官移植實(shí)驗(yàn)提供基本的參考數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣本

對(duì)小群體房山封閉群小型豬采抗凝血22份，分別為EDTA三鉀抗凝和肝素鋰抗凝，雌雄各半，樣品由北京市琉璃河科興實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2012-0005。小型豬年齡：成年，數(shù)量：22頭，性別：雌雄各半。該品種引種自背景來源清晰的中國農(nóng)大小型豬，在北京市琉璃河科興實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心進(jìn)行封閉繁育20多年。

1.2 主要儀器及設(shè)備

日本光電Mek7222血細(xì)胞分析儀

1.3 試劑

清洗液DH520，清洗液DH620，稀釋液DH640，溶血?jiǎng)〥H910, 溶血?jiǎng)〥H680均購自上海東湖生物醫(yī)學(xué)有限公司。EDTA-3K抗凝劑的濃度為15g/L，肝素鋰抗凝劑的濃度為1%。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法 [9]

血液生理指標(biāo)：紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白濃度(HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白(MCH)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細(xì)胞分布寬度(RDW)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、平均血小板體積(MPV)、血小板壓積(PCT)和血小板分布寬度(PDW)，共22項(xiàng)。

用日本光電MEK-7222K血球分析儀測(cè)定，儀器精度：WBC 2.0%，RBC 1.5%，HGB 1.5%，MCV 1.0%，PLT 4.0%。樣品測(cè)定前后應(yīng)進(jìn)行空白測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 不同抗凝劑對(duì)血液生理指標(biāo)的影響

共測(cè)定22項(xiàng)血液生理指標(biāo)，其中1個(gè)指標(biāo)MON有差異(P<0.05), MCV、MCHC、PLT、PCT、MPV、LYM、EOS、BAS、LYM %、MON%、EOS%和BAS%這12個(gè)指標(biāo)差異有顯著性(P<0.01)，其他9項(xiàng)指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

2.2 EDTA三鉀抗凝血的血液生理指標(biāo)結(jié)果

共測(cè)定22項(xiàng)血液生理指標(biāo)，其中PLT、 NEUT和NEUT%3項(xiàng)指標(biāo)有性別差異(P<0.05)， MON、EOS、MON%和EOS%4項(xiàng)指標(biāo)性別差異有顯著性(P<0.01)；其他15項(xiàng)指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

表1 小型豬的血液生理參數(shù)

表2 小型豬EDTA三鉀抗凝的血液生理參數(shù)

表3 小型豬肝素鋰抗凝的血液生理參數(shù)

2.3 肝素鋰抗凝血的血液生理指標(biāo)結(jié)果

共測(cè)定22項(xiàng)血液生理指標(biāo)，其中PDW、NEUT和 LYM%3項(xiàng)指標(biāo)有性別差異(P<0.05)，MON、EOS、MON%、NEUT%和EOS%5項(xiàng)指標(biāo)性別差異有顯著性(P<0.01)；其他14項(xiàng)指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表3)。

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液生理指標(biāo)的重要性

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血液生理指標(biāo)是生物醫(yī)學(xué)研究中重要的指標(biāo)，是判斷健康動(dòng)物狀態(tài)和選擇合格動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)，是病理學(xué)、毒理學(xué)等研究的重要參考依據(jù)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液生理參數(shù)主要受動(dòng)物自身的遺傳因素與環(huán)境因素決定與控制。往往遺傳因素是決定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液生理參數(shù)的內(nèi)在物質(zhì)基礎(chǔ)，環(huán)境因素是決定血液生理參數(shù)變化的外在條件。其中遺傳因素決定的大小，常常用遺傳度表示。某種動(dòng)物的血液生理生化參數(shù)都有特定的波動(dòng)范圍，這種范圍構(gòu)成了每種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物特有的生物學(xué)特性參數(shù)[10，11]。

3.2 兩種抗凝劑對(duì)血液生理指標(biāo)的影響

分別用EDTA三鉀和肝素鋰抗凝的血液生理指標(biāo)，該兩種抗凝劑對(duì)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響無差異，對(duì)平均紅細(xì)胞體積MCV和平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度MCHC的影響差異有顯著性；對(duì)血小板的相關(guān)參數(shù)的影響差異顯著；對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)無影響，但對(duì)白細(xì)胞分類的影響顯著，白細(xì)胞分類中，除了中性粒細(xì)胞外的，對(duì)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞含量及其百分比都有顯著影響。如果實(shí)驗(yàn)中主要考察的目標(biāo)是白細(xì)胞分類的相關(guān)指標(biāo)，或者血小板相關(guān)參數(shù)，那么在結(jié)果分析的時(shí)候，一定要考慮到抗凝劑對(duì)相關(guān)指標(biāo)的影響。如果實(shí)驗(yàn)中分多次采血取樣，那么應(yīng)選用同一種抗凝劑，盡量減少不同的抗凝劑對(duì)血液生理指標(biāo)的影響，避免由此帶來的實(shí)驗(yàn)偏差。血液生理指標(biāo)在不同抗凝劑之間存在一定的差異，在一定程度上說明，血液生理值除了受遺傳基因控制外，抗凝劑的種類對(duì)其血液生理指標(biāo)的影響巨大。

3.3 性別差異對(duì)血液生理指標(biāo)的影響

經(jīng)過EDTA三鉀處理的血液生理指標(biāo)：血小板、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞等指標(biāo)有性別差異，且差異顯著；大多數(shù)指標(biāo)差異無顯著性。說明血液生理值受遺傳基因控制，并且與不同性別生理代謝過程的差異有關(guān)系。經(jīng)過肝素鋰處理的血液生理指標(biāo)：血小板、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞存在性別間差異；大多數(shù)指標(biāo)差異無顯著性，說明血液生理值受遺傳基因控制，并且與不同性別生理代謝過程的差異有關(guān)系。即使選用同樣的抗凝劑，血液生理指標(biāo)在雌雄之間仍然存在差異，主要表現(xiàn)在血小板和白細(xì)胞分類上面。那么在實(shí)驗(yàn)中，要考慮到性別差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，同一個(gè)實(shí)驗(yàn)中選取同一性別的動(dòng)物。如果分不同批次，應(yīng)保持不同批次間性別一致，以便于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，排除干擾。

3.4 抗凝劑對(duì)血小板計(jì)數(shù)的影響

有報(bào)道稱EDTA鹽抗凝的人類血小板計(jì)數(shù)可能出現(xiàn)急劇下降的現(xiàn)象。邢輝等報(bào)道稱：“EDTA鹽有時(shí)可導(dǎo)致血小板發(fā)生聚集從而導(dǎo)致血液分析儀做血小板計(jì)數(shù)時(shí)出現(xiàn)假性偏低的現(xiàn)象?！眲⑶帙i等報(bào)道稱：“一些患者采用EDTA-K2抗凝血利用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)結(jié)果的假性異常降低?！倍椅墨I(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)顯示，出現(xiàn)這樣的病例在中國并不多見。通過我們的研究發(fā)現(xiàn)，無論是EDTA三鉀還是肝素鋰抗凝的小型豬血液樣本，均沒有出現(xiàn)血小板計(jì)數(shù)急劇下降的現(xiàn)象。[12-13]

3.5 血液生理指標(biāo)中的敏感指標(biāo)

無論用何種抗凝劑抗凝，小型豬雌雄之間的血液生理指標(biāo)差異都出現(xiàn)在血小板和白細(xì)胞分類當(dāng)中。說明血小板和白細(xì)胞分類是容易收到干擾并發(fā)生改變的敏感指標(biāo)。雌雄之間的血液生理指標(biāo)的差異不因抗凝劑的不同而有異，差異還是那幾個(gè)指標(biāo)的差異。說明血液生理指標(biāo)主要取決于遺傳因素，并存在性別差異。這種差別可能與動(dòng)物的生長環(huán)境以及新陳代謝水平有關(guān)。

血液生理參數(shù)主要受動(dòng)物自身的遺傳因素與環(huán)境因素決定與控制。遺傳因素是決定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液生理參數(shù)的內(nèi)在物質(zhì)基礎(chǔ)，環(huán)境因素是決定血液生理參數(shù)變化的外在條件。因性別以及新陳代謝水平等因素的不同，動(dòng)物往往表現(xiàn)出各異的生理參數(shù)。作為一類重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，小型豬的血液生理值在一定程度上反映了動(dòng)物的新陳代謝和生理機(jī)能狀況，了解小型豬的生理指標(biāo)對(duì)該動(dòng)物的飼養(yǎng)管理以及實(shí)驗(yàn)應(yīng)用都具重要的參考價(jià)值。小型豬在血液生理方面的特性將有助于其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的開發(fā)和利用[14-18]。

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